云龍石斑魚胃排空特征和攝食消化特性研究*

高云紅 景琦琦 黃 濱 關長濤 張佳偉李文升 翟介明 賈玉東①

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；2. 青島國家科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071；4. 萊州明波水產有限公司 萊州 261400)

魚類的攝食和消化是一個復雜的動態生理過程，多種激素和消化酶參與其中，保證其有序進行。在激素和消化酶的作用下，魚類形成各自特有的胃排空類型，一直以來，研究者都將胃排空率(Gastric evacuation rate, GER)作為評價魚類消化功能的重要指標(余方平等, 2007)。胃排空率是指攝食后食物從胃中排出的速率(李可貴等, 2009)。自20世紀60年代起，胃排空率被廣泛應用于魚類生理、生態學的評價。迄今為止，國內學者已對多種養殖魚類的胃排空率進行了系統研究，并以多種數學模型擬合胃排空率，為科學制定養殖魚類投喂頻率提供重要參數。馮憲斌等(2012)深入分析了巖原鯉(Procypris rabaudi)幼魚胃排空率和攝食量；余方平等(2007)測定了美國紅魚(Sciaenops ocellatus)的胃排空率；郭浩宇等(2017)闡明了許氏平鲉(Sebastes schlegelii)幼魚的胃排空特征；仇登高等(2018)明確了投喂頻率對鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)胃排空率及消化酶的影響。研究表明，魚類胃排空率受自身內在因素和諸多外在因素的共同影響，如魚類的種屬、日齡、飼養溫度、飼料種類、投喂頻率等(張波等, 2001)。攝食后，魚類攝食神經中樞產生神經沖動，刺激下丘腦垂體分泌促進攝食或抑制攝食因子，加之食物攝入后對胃腸道刺激，生理性反饋調控攝食因子分泌，引起血液生理指標和消化酶活性的變化，影響魚類攝食行為發生。而攝食消化過程中，胃排空率與魚類血液生理狀態和消化酶活性變化是否具有相關性目前尚未有深入研究。因此，闡明魚類血液生理、消化酶和胃排空之間的關系，將有助于了解其食欲恢復狀況，科學制定最佳投喂方案，對魚類高效健康養殖和經濟性狀調控意義重大。

云龍石斑魚(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)是由中國水產科學研究院黃海水產研究所與萊州明波水產有限公司選育的石斑魚新品種，其父本為鞍帶石斑魚，母本為云紋石斑魚(E. moara)，云龍石斑魚兼具二者優點，具有肉質鮮美、營養價值高、生長速度快的特點(唐江等, 2018; 李振通等, 2019; 成美玲等,2018)。2016 年初全面推向市場后，獲得了極高贊譽。目前，對云龍石斑魚的研究主要集中在親本表型數量性狀分析、幼魚溫度和鹽度適應調控機制(邢道超等,2017)、肌肉營養成分分析及品質評價(王林娜等, 2018)等方面，而有關云龍石斑魚攝食投喂的研究尚未見報道。本文通過研究云石斑魚攝食后胃排空特征，比較線性模型、平方根模型和立方模型對胃排空曲線的擬合程度，構建云龍石斑魚胃排空的最佳數學模型，查明云龍石斑魚攝食后血清中葡萄糖、皮質醇含量和肝臟消化酶活性的變化規律，旨在優化云龍石斑魚養殖投喂策略，為實現標準化養殖提供有效技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚由萊州明波水產有限公司提供，共150尾，平均體重為(680.35±39.84) g，體長為(30.05±1.72) cm。實驗前在5 m×5 m×1.5 m養殖池中暫養1周(50尾/池，共3個養殖池)，水溫為18℃～19℃，溶氧為9～10 mg/L，pH為7.8～8.2，NH3-N＜0.5 mg/L。采用循環水飼養，每天投喂2次(間隔12 h)。投喂海童系列商品配合飼料(粗蛋白≥48%，粗脂肪≥10%，粗灰分≤17.0%，Ca≤4.0%，賴氨酸≥2.5%，總磷≥1.5～3.0，含少量幾丁質的蝦或蟹)。

1.2 實驗設計與樣品收集

實驗開始前24 h 停止投喂，以保證其消化道徹底排空。實驗開始時，用顆粒飼料進行一次性飽食投喂，1 h 后清除殘餌。在投喂后0、3、6、9、12、15、18 和24 h，依次從每個養殖池中取6 尾魚，MS-222(100 mg/L)麻醉，解剖取樣。測定全長、體長和體重，尾靜脈取血，置于1.5 ml 的EP 管中，靜置15～20 min，3500 r/min 離心10 min，取上清液，保存于–20℃，用于檢測皮質醇和葡萄糖含量。解剖取出胃、肝臟和腸組織。以濾紙吸干胃表面水分、稱重，排凈胃內容物；用蒸餾水反復清洗胃內壁，濾紙吸干、稱重，所得重量差值即為胃內容物質量(濕重)(曾令清等, 2011)；肝臟和腸組織于–20℃保存，用于檢測消化酶活性。

1.3 樣品處理與指標檢測

1.3.1 血清中皮質醇和葡萄糖含量測定 血清中葡萄糖含量采用南京建成公司試劑盒檢測，血清中的葡萄糖經葡萄糖氧化酶的作用生成葡萄糖酸和H2O2，后者在過氧化物酶的作用下，將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯縮合成可被分光光度計測定的物質，所用波長為505 nm，單位為mmol/L。血清中皮質醇含量采用競爭法檢測，向預先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入生物素標記的識別抗原，在37℃下孵育30 min，經PBST 洗滌5 次后，加入親和素HRP，在37℃下孵育30 min，洗滌后加入顯色液，37℃顯色10 min，再加入終止液，在450 nm 波長下檢測，單位為ng/ml。

1.3.2 消化酶的測定 準確稱重肝臟和腸組織，按重量(g)∶體積(ml)=1∶9，加入9倍體積1.2%的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，2500 r/min，離心10 min，取上清液，以生理鹽水1∶9稀釋為1%組織勻漿。肝臟和腸組織總蛋白濃度，淀粉酶、糜蛋白酶、脂肪酶比活力均采用南京建成公司試劑盒檢測，波長為562、660、580和660 nm，所用儀器為UV 2800紫外可見分光光度計。

1.3.3 胃排空率計算 胃內容物殘余百分比計算公式為：

式中，P 表示任一取樣時間胃內容物重量(濕重)占總攝食量的百分比，W0表示在任一取樣時間時胃內容物的重量，W1表示實驗魚飽食狀態下的總攝食量(謝小軍等, 1998)。

用線性、立方根和平方根3 種數學模型分別擬合云龍石斑魚胃排空率實驗數據。各數學模型公式如下：

線性模型：Y=A–Bt

立方模型：Y=At3+Bt2+Ct+D

平方根模型：Y0.5=A–Bt

式中，Y 為胃內殘余食物的濕重；t 為進餐后的時間；A、B、C、D 為常數。

采用SPSS 18.0 和GraphPad Prism 7.0 進行數據統計分析及繪圖。通過比較分析各擬合模型的相關系數(R2)、殘差標準差(SDR)、殘差平方和(RSS)值，確定云龍石斑魚最佳胃排空模型。

以相鄰取樣點胃內容物量差值(St)的自然對數值與所對應的間隔取樣時間(t)進行線性回歸，其線性方程為：

式中，所得線性方程的斜率a 即為云龍石斑魚的瞬時排空率(劉麗華等, 2005)。

1.4 數據分析

實驗數據采用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，當差異達到顯著水平，進行Duncan 氏多重比較。數據用平均值±標準誤(Mean±SEM)表示，P＜0.05 為差異顯著。3 種數學模型的參數A、B、C、D 均由統計軟件進行曲線擬合得到。

2 結果

2.1 云龍石斑魚胃排空特征及胃排空模型

飽食投喂后，云龍石斑魚的胃內容物百分比隨時間呈規律性變化(圖1)。投喂后，云龍石斑魚胃內容物百分比呈逐漸下降的趨勢，3～6 h 急劇下降，由88.5%降至33.2%，差異顯著(P＜0.05)，0～3、6～15 h胃內容物百分比下降速率較緩，攝食后15 h，胃內容物基本排空，屬于典型的先慢后快再慢胃排空類型。

圖1 云龍石斑魚胃排空變化Fig.1 The changes of gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀× E. lanceolatus ♂)

利用SPSS 軟件將實驗結果與數學模型進行擬合，可知線性模型、平方根模型、立方模型均可擬合本實驗胃排空率(圖2)。從R2來看，立方模型＞平方根模型＞線性模型；從RSS 來看，線性模型＞平方根模型＞立方模型；從SDR 來看，線性模型＞平方根模型＞立方模型(表2)。綜合R2、RSS、SDR 結果，立方模型對云龍石斑魚胃排空率的擬合程度最佳，其公式為Y=–0.001t3+ 0.099t2–2.644t+20.677，根據公式可得，投喂后14.8 h，胃內容物完全排空。

2.2 云龍石斑魚消化酶的變化

云龍石斑魚消化酶呈規律性變化(圖3)。飽食投喂后0～3 h，云龍石斑魚肝臟內淀粉酶活性無顯著變化，3～6 h 呈急劇上升趨勢(P＜0.05)，6 h 時活性達到最高值(0.151 U/g prot)，之后呈下降趨勢，至投喂后15 h 時，肝臟內淀粉酶活性恢復至初始水平，而投喂后云龍石斑魚腸道內的淀粉酶活性無顯著變化，且肝臟內淀粉酶活性高于腸道內淀粉酶活性(圖3A)。肝腸內的糜蛋白酶、脂肪酶活性均呈現先升高后降低的變化趨勢，且均在飽食投喂后6 h 時，活性達到最高(P＜0.05)，隨后顯著下降(圖3B、圖3C)。同時，腸道內糜蛋白酶活性顯著高于肝臟(P＜0.05)。如表2 所示，云龍石斑魚瞬時胃排空率與肝腸消化酶(除腸道內淀粉酶)均呈正相關(P＜0.05)，消化酶之間無顯著相關性。

表1 云龍石斑魚胃排空曲線的3 種數學模型擬合Tab.1 The fitting with 3 types of mathematical models for gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)

圖2 云龍石斑魚胃排空曲線的3 種數學模型擬合Fig.2 The fitting with 3 types of mathematical models for gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀×E. lanceolatus ♂)

2.3 云龍石斑魚血清皮質醇和葡萄糖的變化

云龍石斑魚血清中皮質醇和葡萄糖的含量均呈先升高后降低的變化趨勢(圖4)。投喂后0～3 h，云龍石斑魚血清中葡萄糖含量逐漸升高，3～6 h 急劇升高，差異性顯著(P＜0.05)，6 h 時葡萄糖含量達到最高(21.02 mmol/L)，6～18 h 呈下降趨勢，18 h 后血清中葡萄糖含量不再變化(圖4A)。血清中皮質醇含量同葡萄糖含量呈相似的變化趨勢，投喂后，血清中皮質醇含量逐漸升高，3～6 h 急劇增加，差異顯著(P＜0.05)，6 h 時，其含量達到最高(152.6 mmol/L)。6 h 后，血清中皮質醇含量呈顯著下降趨勢，12 h 后無顯著差異(圖4B; P＞0.05)。

3 討論

3.1 魚類胃排空方式與模型選擇

魚類種屬多樣，攝食習性和消化道結構存在差異，胃排空方式復雜多樣。研究表明，魚類胃排空方式主要有3 種類型：直線下降型、先快后慢型和先慢后快再慢型。胃排空類型與食物類型、飼料組成及魚類攝食偏好存在顯著相關性，以大而不易碎食物為食的魚類，胃排空方式多為直線下降型，如黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)(張波等, 2001)、美國紅魚(余方平等, 2007)；以小而易碎食物為食的魚類，多呈先快后慢型，也被稱為固有的內在排空方式，如：黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)(覃志彪等, 2011)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(孫曉峰等, 2011)。本研究中，投喂云龍石斑魚顆粒飼料中添加了幾丁質外殼的蝦或蟹，延緩了消化酶與食物作用的時間，云龍石斑魚胃排空方式呈先慢后快再慢型。日本皇姑魚(Nibea japonica)(朱云海等,2013)、俄羅斯鱘魚(Acipenser gueldenstaedtii)(張濤等,2015)也呈現類似的胃排空方式。

表2 云龍石斑魚瞬時排空率與消化酶相關性分析Tab.2 Correlation between instantaneous emptying rate and digestive enzymes in Yunlong grouper(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)

圖3 云龍石斑魚攝食24 h 內消化酶變化Fig.3 Changes of digestive enzymes of Yunlong grouper (E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂) within 24 hours of feeding

圖4 云龍石斑魚攝食24 h 內血清中葡萄糖和皮質醇變化Fig.4 Changes of glucose and cortisol in serum of Yunlong grouper(E. moara ♀×E. lanceolatus ♂) within 24 hours after ingestion

魚類的胃排空方式復雜多樣，如何選擇并構建合適的胃排空數學模型存在較大爭議。Jobling(1981)首次以數學模型評估了魚類胃排空率變化。隨后，各國研究者紛紛開展了以數學模型擬合胃排空率的研究，但如何選擇合適的數學模型擬合數據，鑒于魚類種屬間差異，仍要根據具體情況進行深入分析研究。目前，常見的數學擬合模型有線性模型、指數模型和平方根模型3 種(張波等, 2001)。本研究中，線性模型、平方根模型、立方模型均可擬合實驗數據，通過統計學分析發現，立方模型擬合度最佳。Ruohonen 等(1998)對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的研究發現，在投喂后15 h，胃內容物消化完全，但在其胃排空率達到80%～90%時(投喂后6 h)，其食欲已經基本恢復，所以，將投喂后6 h 作為最適投喂間隔。Riche 等(2004)對尼羅羅非魚的研究同樣可以證實這一點。根據立方模型公式得出，云龍石斑魚在投喂后9.5 h 胃排空率達到80%，14.8 h 時，胃內容物全部排空。

3.2 消化酶活性分析

消化酶依據消化對象不同分為淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，其活性變化直接影響魚類對營養物質的消化吸收，進而調控魚類的生長發育(Vera et al,2007)。魚類消化酶活性受魚類種屬、生理狀態、發育階段等內在因素和水溫、鹽度、飼料等外在因素共同影響(黃瑾等, 2011)。魚類食性不同，消化道內消化酶組成和活性存在顯著差異，肉食性魚類消化道短，食物的消化吸收主要在腸道，腸道中蛋白酶活性遠高于其他組織(區又君等, 2012; 向梟, 2002; 吳水清,2014)。本研究結果顯示，攝食后云龍石斑魚肝臟和腸道內消化酶活性均呈規律性變化，且在肝臟和腸道內消化酶分布有所不同。肝臟中淀粉酶呈先升高后降低的變化趨勢，腸道內淀粉酶活性無顯著變化，腸道內糜蛋白酶活性顯著高于肝臟內糜蛋白酶活性，脂肪酶在肝臟和腸道內活性均呈先升高后降低的趨勢。吳婷婷等(1994)對鱖魚(Siniperca chuatsi)、青魚(Mylopharyngodon piceus)、鯉(Cyprinus carpio)、鯽(Carassius auratus)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)和鰱(Hypophthalmichthys molitrix)消化酶活性的研究中也得到了類似結果，發現草魚、鯉、鰱肝臟內淀粉酶活性要高于腸道內淀粉酶活性，但青魚和鯽肝臟內淀粉酶活性顯著低于腸道內淀粉酶活性。付新華等(2005)對大菱鲆(Scophalmus maximus)的研究發現，腸是水解脂肪和淀粉的主要器官，而腸水解蛋白的能力較弱。魚類消化酶分布廣泛，種屬差異必然會造成其時空分布及表達活性不同。Santos 等(2016)也得出了相似的結論。云龍石斑魚作為肉食性魚類，其糜蛋白酶活力和脂肪酶活性顯著高于淀粉酶活性，同時，胃排空速率與肝腸消化酶呈顯著正相關關系。

3.3 血液生理學變化

哺乳動物下丘腦中存在中樞葡萄糖感應器和整合與發放食欲信號的中樞，可通過監測機體內葡萄糖的變化控制動物體的攝食情況(楊麗萍等, 2014)。Fuentes等(2013)發現，魚類存在與哺乳動物類似的攝食調控機制，葡萄糖同樣對魚類的攝食有著重要的調控作用。本研究中，攝食后，云龍石斑魚血清中葡萄糖含量顯著升高，6 h 時達到峰值，且在3～12 h 時，血清中葡萄糖含量持續維持在較高水平，認為此時云龍石斑魚食欲尚未恢復，不適宜投喂。李晨晨等(2018)在對黃顙魚的研究中指出，攝食后魚體血清葡萄糖濃度顯著升高，且飼喂不同飼料葡萄糖升高濃度有所不同。皮質醇為糖皮質激素，皮質醇誘導葡萄糖水平升高，促進脂肪積累(Kominiarek et al, 2018)。葡萄糖和皮質醇協同作用，共同參與調節魚類攝食和營養物質的攝取。Milligan 等(2003)對虹鱒的研究發現，皮質醇可以激活肝臟內酶活性，促進糖元合成。因此，攝食后4～9 h 中，血清中皮質醇濃度顯著升高，可能主要用于葡萄糖合成，但具體代謝調控機制尚不明確，需要進一步研究。

4 結論

綜上所述，攝食后云龍石斑魚血清內葡萄糖和皮質醇含量、肝臟及腸道內消化酶活性均呈規律性變化，胃排空率呈典型的先慢后快再慢類型，其最優擬合模型為立方模型，根據模型可知，云龍石斑魚食欲基本恢復時間為投喂后9.5 h (80%胃排空)，基于以上數據結合生產實際，云龍石斑魚每日飼喂2 次，每次間隔10 h 左右效果最佳。