鹽度脅迫對大鱗鲃抗氧化酶和血清皮質(zhì)醇的影響*

張宇婷 楊 建 耿龍武 王 雨 姜海峰 徐 偉①

(1. 上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所哈爾濱 150070；3. 上海海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種植資源重點實驗室 上海 201306)

鹽度是影響魚類機體生理生化狀態(tài)的重要環(huán)境因子之一，對魚類的生存(嚴銀龍等, 2019)、生長發(fā)育(El-Leithy et al, 2019)影響顯著。研究表明，廣鹽性魚類在轉入高鹽度水體過程中，機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，會消耗大量的能量，同時產(chǎn)生大量的有害代謝產(chǎn)物，如超氧負離子自由基、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)等(胡靜等, 2015)，而機體內(nèi)的非特異性免疫酶類，如酸性磷酸酶(Acidic phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)等則在保護機體免受過氧化物二次損傷過程中發(fā)揮著重要作用；而皮質(zhì)醇則在能量代謝和免疫調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。當魚類長期處于脅迫環(huán)境時，會導致其機體代謝紊亂、免疫機能下降，甚至引起魚類的死亡(Li et al, 2017;Hoseini et al, 2019; 齊明, 2014)。

大鱗鲃為鯉科(Cyprinidae)、鲃亞科(Barbinae)、鲃屬(Barbus)魚類(Nikoriski, 1958)。目前，關于大鱗鲃的鹽度適應性研究主要集中在生存(楊建等, 2014)、生長發(fā)育(黨云飛等, 2013)、滲透調(diào)控(耿龍武等, 2011)等方面。在免疫機能的影響方面，僅初步檢測了超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)在肝、腎和鰓組織中的時空變化(楊建,2014)。為全面揭示鹽度脅迫對大鱗鲃機體免疫應激水平的影響，以便為大鱗鲃鹽堿水域的養(yǎng)殖提供更加準確、有效的參考，本研究檢測分析不同鹽度脅迫下，大鱗鲃肝、腎和鰓組織中ACP、AKP、GSH-Px 和MDA 等氧化應激參數(shù)和血清皮質(zhì)醇水平的變化，以期闡明鹽度脅迫對大鱗鲃抗氧化能力和機體應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚取自中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗站。隨機選300 尾體長為(25.0±0.5) cm、體重為(95.00±5.56) g 的健康、體型正常的個體于室內(nèi)暫養(yǎng)3 d，暫養(yǎng)用水為曝氣2 d 的自來水，水溫為(24.0±1.5)℃。

根據(jù)楊建等(2014)的結果和鹽度預實驗結果，本實驗設置4 個NaCl 鹽度實驗組(3、6、9 和12 g/L)和1 個淡水對照組，每個梯度設置3 個平行組。實驗溶液采用曝氣2 d 的自來水和NaCl(國產(chǎn)，分析純)在體積為200 L 的玻璃缸中進行配制，并用鹽度測量儀(上海三信儀表廠，SX713-02 型)檢測校準。溶液配制完成后穩(wěn)定2 d。各實驗組隨機挑選20 尾大鱗鲃進行為期7 d 的耐受實驗，實驗期間水溫為(24.0±1.5)℃。

1.2 實驗方法與樣品采集

各組分別于實驗開始后3、6、12、24、48、96 h和7 d 進行樣品采集，用40 mg/L 的MS-222 在實驗相同鹽度梯度下麻醉，每個鹽度實驗組在每個時間點于3 個平行組隨機采集1 尾實驗魚，共采集3 尾。尾部靜脈采集血液樣本，4℃條件下3000 r/min 離心10 min，取上清液，–80℃保存待測；冰上解剖實驗魚，采集其肝、腎和鰓組織，并用4℃預冷的生理鹽水潤洗，用吸水紙吸干后迅速放入凍存管，液氮保存待測。

1.3 組織氧化應激指標和血清皮質(zhì)醇測定

取0.2 g 肝、腎和鰓組織樣本，按照質(zhì)量與體積比1∶9 加入預冷的0.86%生理鹽水，用組織研磨儀(MM400, Retsch) 10000～15000 r/min 研磨成10%組織勻漿。將制備好的10%勻漿4℃條件下2500 r/min 離心10 min，取上清液，用于測定ACP、AKP、MDA和GSH-PX 等氧化應激指標，測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

采用酶聯(lián)免疫法ELISA 和Synergy HTX 多功能檢測儀(Bio Tek)測定大鱗鲃血清皮質(zhì)醇，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司(Cat.# m1003467-C)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗結果采用SPSS 20.0 與Graphpad prism5 進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，實驗結果用平均值±標準差(Mean±SD)表示。同一時間點的不同鹽度組進行Duncan′s 多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鹽度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓ACP 活力的影響

由圖1 可知，在脅迫初期，相同鹽度脅迫時間，3 種組織中ACP 的活力均隨著鹽度的升高而升高；而在相同鹽度條件下，大鱗鲃的肝、腎和鰓中的ACP活力隨著時間的延長均呈先上升后下降并趨于平穩(wěn)的變化趨勢。肝、腎和鰓中ACP 活力分別在脅迫12、6 和24 h 達到峰值，之后逐步下降并趨于穩(wěn)定；而淡水對照組3 種組織中ACP 活力的變化范圍分別為1.27～1.42、1.46～1.62 和0.98～1.17 U/g prot，在整個實驗過程中酶活力變化不大。此外，腎中ACP 活力顯著高于肝和鰓，其在肝、腎和鰓組織中的活力范圍分別為1.27～1.96、1.42～2.15 和0.98～1.96 U/g prot。

2.2 鹽度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓AKP 活力的影響

圖1 鹽度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織的ACP 活力的影響Fig.1 Effects of salinity stress on ACP activity in liver,kidney and gill of L. capito

由圖2 可知，在鹽度脅迫初期，在相同脅迫時間下，肝、腎和鰓組織中AKP 活力隨著鹽度的升高顯著升高(P＜0.05)；而在同一鹽度脅迫下，大鱗鲃3 種組織中的AKP 活力隨著時間的延長亦呈先上升后下降并趨于平穩(wěn)的變化趨勢。肝和腎組織中AKP 活力在12 h 時最大，而鰓組織則在24 h 出現(xiàn)峰值；肝和腎組織自24 h 開始下降并趨于平穩(wěn)，而鰓組織在48 h時下降后趨于平穩(wěn)。淡水對照組3 種組織中AKP 的活力范圍分別為0.32～0.37、1.03～1.23 和0.98～1.17金氏單位/g prot，在整個實驗過程中AKP 活力變化不顯著(P＞0.05)。AKP 活力在腎組織中顯著高于其他2種組織，其在肝、腎和鰓組織中的變化范圍分別為0.31～0.86、1.01～1.87 和0.13～0.84 金氏單位/g prot。

2.3 鹽度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓GSH-Px 活力的影響

圖2 鹽度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織的AKP 活力影響Fig.2 Effects of salinity stress on AKP activity in liver,kidney and gill of L. capito

由圖3 可知，初期相同脅迫時間下，肝、腎、鰓組織的GSH-Px 活力隨鹽度的升高而升高；隨著脅迫時間的延長，大鱗鲃3 種組織中的GSH-Px 活力在相同鹽度脅迫下呈先上升后下降并趨于平穩(wěn)的變化趨勢。肝和腎組織中GSH-Px 的活力在脅迫24 h 達到峰值，鰓組織則在脅迫6 h 達到頂峰；腎和鰓組織均在96 h 時趨于平穩(wěn)，肝組織則在7 d 時趨于穩(wěn)定；淡水對照組3 種組織中GSH-Px 活力的變化范圍分別為44.41～46.68、17.19～21.59 和9.07～13.18 活力單位，在整個實驗過程中變化差異不大。此外，肝組織的GSH-Px 活力顯著高于腎和鰓組織，GSH-Px 在肝、腎和鰓組織中的活力范圍分別為 44.41～114.77、16.25～67.59 和9.07～48.00 活力單位。

圖3 鹽度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織GSH-Px 活力的影響Fig.3 Effects of salinity stress on GSH-Px activity in liver,kidney and gill of L. capito

2.4 鹽度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織中MDA 含量的影響

由圖4 可知，脅迫初期相同時間點，大鱗鲃肝、腎和鰓的 MDA 含量亦隨鹽度的升高而顯著升高(P＜0.05)；大鱗鲃的肝、腎和鰓中的MDA 含量在相同鹽度條件下，隨著脅迫時間的延長均呈先上升后下降，并趨于平穩(wěn)的變化趨勢。其中，3 種組織中MDA含量均在脅迫24 h 時達到峰值，腎組織在96 h 時MDA 含量趨于穩(wěn)定，肝組織則在7 d 時達到新穩(wěn)態(tài)，鰓組織在7 d 內(nèi)仍未恢復正常水平。淡水對照組3 種組織中MDA 含量分別為18.63～22.55、13.05～18.89和8.33～11.32 nmol/mg prot，在整個實驗過程中變化不大(P＞0.05)。此外，MDA 含量在腎組織中略高于肝和鰓組織，其在肝、腎和鰓組織中的變化范圍分別為17.02～55.98、13.05～57.27 和8.33～53.93 nmol/mg prot。

圖4 鹽度脅迫對大鱗鲃肝、腎和鰓組織MDA 含量的影響Fig.4 Effects of salinity stress on MDA content in liver,kidney and gill of Luciobarbus capito

2.5 鹽度脅迫對大鱗鲃血清皮質(zhì)醇的影響

由圖5 可知，大鱗鲃血清皮質(zhì)醇濃度在脅迫初期同一脅迫時間下，隨鹽度的升高呈顯著升高的變化趨勢(P＜0.05)；在同一鹽度條件下，隨著脅迫時間的延長，大鱗鲃血清皮質(zhì)醇呈先上升后下降，并趨于平穩(wěn)的變化趨勢。血清中的皮質(zhì)醇濃度在脅迫24 h 時達到峰值，在鹽度脅迫48 h 時趨于平穩(wěn)；鹽度脅迫組大鱗鲃血清皮質(zhì)醇濃度為197.00～355.5 ng/L。而淡水對照組血清皮質(zhì)醇則為197.00～209.00 ng/L，其在整個實驗過程中含量變化差異不大。此外，血清皮質(zhì)醇的濃度變化與鹽度呈正相關。

圖5 鹽度脅迫對大鱗鲃血清皮質(zhì)醇濃度的影響Fig.5 Effects of salinity stress on serum cortisol concentration in L. capito

3 討論

ACP 和AKP 的磷酸化和去磷酸化主要作用于機體解毒過程，是衡量機體免疫機能的重要指標(Sarà et al, 2008)。本研究發(fā)現(xiàn)，12 g/L 高鹽脅迫組中大鱗鲃肝、腎和鰓中ACP 和AKP 活力均高于其他3 個低鹽度組，表明鹽度越高，機體代謝強度越大，參與調(diào)控機體相關酶類磷酸化和去磷酸化過程的ACP 和AKP 活性也越高，徐力文等(2008)對軍曹魚(Rachycentron canadum)在鹽度脅迫下的研究也得出相同結論。在相同鹽度下，脅迫初期大鱗鲃3 種組織中ACP 和AKP 活力顯著上升，并在24 h 內(nèi)達到頂峰，脅迫48 h 后逐步下降并趨于平緩；但不同鹽度脅迫下，最終恢復平穩(wěn)的時間不同，高鹽度組恢復穩(wěn)定的時間顯著長于低鹽組；此外，不同組織ACP 和AKP活力恢復穩(wěn)定的時間也不同，其中，肝組織中ACP和AKP 活力分別在7 d 和4 d 達到新穩(wěn)態(tài)，腎組織中2 種酶的活力均在48 h 達到平穩(wěn)狀態(tài)，而鰓組織AKP活力在脅迫96 h 后恢復穩(wěn)定。腎組織中ACP 和AKP活力范圍分別為1.42～2.15 U/g prot 和1.01～1.87 金氏單位/g prot，其在3 種組織中活性最高，且恢復時間最短，而肝組織中酶活力恢復穩(wěn)定的時間則晚于腎組織，這可能與肝組織需要持續(xù)為機體提供能量有關。此外，鰓中酶活力范圍分別為0.98～1.96 U/g prot 和0.13～0.84 金氏單位/mg prot，鰓組織ACP 和AKP 活力恢復所需時間亦較長，這可能與鰓直接接觸鹽度環(huán)境且酶活力較低有關系。

GSH-Px 是機體用于清除過氧化物的一種酶，能以GSH 為特異性底物降解過氧化氫和有機過氧化物，對維持細胞膜結構和功能的完整性具有重要的保護作用(Arthur, 2000)。本研究結果顯示，大鱗鲃肝、腎和鰓3 種組織在高鹽度脅迫下(12 g/L)的同一時間，GSH-Px 活力顯著高于低鹽度組，且鹽度變化與GSH-Px 活力呈正相關性；推測在高鹽脅迫下，機體代謝調(diào)控強度加大，為避免機體產(chǎn)生的過氧化氫和有機過氧化物對機體造成二次損傷，GSH-Px 活力也相應增強，這與孫鵬等(2010)的報道一致。在相同鹽度條件下，脅迫初期大鱗鲃3 種組織中GSH-Px 活力顯著上升，其肝組織和腎組織在24 h 達到頂峰，而鰓組織則在6 h 達到峰值，在脅迫48 h 后逐步下降并趨于平穩(wěn)；高鹽度組恢復穩(wěn)定的時間明顯長于低鹽度組；此外，3 種組織中GSH-Px 活力最終恢復穩(wěn)定的時間不同，肝組織中GSH-Px 活力在7 d 達到新穩(wěn)態(tài)，而腎和鰓均在96 h 恢復穩(wěn)定；此外，肝組織中GSH-Px活力最高，腎和鰓次之。肝是機體代謝供能的主要組織，其在機體鹽度適應過程中需要高強度持續(xù)供能，產(chǎn)生的過氧化代謝廢物多，因此，GSH-Px 在活力和恢復穩(wěn)定所需時間均顯著強/長于腎、鰓組織。

MDA 是生物體脂質(zhì)代謝過程中一種重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是衡量機體內(nèi)活性氧的水平和氧化應激程度的重要指標之一(Paust et al, 2011)。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫初期，相同時間下高鹽度組(12 g/L)大鱗鲃肝、腎和鰓組織中MDA 含量明顯高于低鹽度組，且鹽度越高，機體代謝產(chǎn)生的MDA 越多，這與楊靜雯等(2019)對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)在鹽度脅迫下的結論一致。相同鹽度條件下，脅迫初期大鱗鲃3 種組織中MDA 含量呈顯著上升趨勢，并在24 h 達到最高，脅迫48 h 時逐步下降并基本趨于平穩(wěn)；此外，腎組織中MDA 含量略高于肝和鰓組織。推測在鹽度脅迫下，3 種組織中脂質(zhì)物質(zhì)均參與了分解供能過程，但這一結論仍需進一步的研究證實。

皮質(zhì)醇是在下丘腦–垂體–腎上腺軸(HPI)分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素作用下，由頭腎細胞合成與釋放的一種糖皮質(zhì)類固醇激素，是反應魚體應激強度的重要指標(Zong et al, 2019)。本結果顯示，鹽度脅迫下的血清皮質(zhì)醇在高鹽脅迫下(9 和12 g/L)顯著高于低鹽脅迫(3 和6 g/L)，且皮質(zhì)醇濃度隨鹽度的上升而上升，這與胡靜等(2016)的報道相一致。在同一鹽度下，大鱗鲃血清皮質(zhì)醇在短期內(nèi)急速上升，并在24 h 時升至峰值，表明在魚體剛接觸鹽度環(huán)境時，大鱗鲃的腎間組織受到刺激并分泌大量的皮質(zhì)醇，但隨著脅迫時間的延長，到48 h 時，大鱗鲃逐漸適應了水體鹽度環(huán)境，其血清中皮質(zhì)醇含量亦逐漸恢復至正常水平。

綜上所述，本研究中，3 種組織中抗氧化酶活力、MDA 含量以及血清皮質(zhì)醇，均在24 h 內(nèi)出現(xiàn)最大值，并在48 h 之后逐漸趨于平穩(wěn)，推測大鱗鲃在剛進入鹽度環(huán)境時，魚體對外界環(huán)境產(chǎn)生了劇烈反應，在曝露24 h 內(nèi)機體抗氧化能力逐步達到最強，之后隨著時間的延長，魚體逐步適應相應的鹽度環(huán)境，其抗氧化能力也隨之恢復到正常水平，各指標均基本趨于平穩(wěn)。整個實驗過程中未出現(xiàn)大鱗鲃死亡現(xiàn)象，且在12 g/L 高鹽脅迫下3 種組織中各項指標均能恢復穩(wěn)定水平，表明大鱗鲃對于高鹽水體環(huán)境具有較強的適應性，且能夠在12 g/L 高鹽環(huán)境下中正常生長。