城市化對土壤微生物多樣性的影響

仇午丹，方 倩

（浙江人欣檢測研究院股份有限公司，浙江 寧波 315000）

1.引言

土壤是農業可持續發展的物質基礎，土壤微生物是土壤的重要組成部分，其在土壤養分轉化循環、統穩定性和抗干擾能力以及土壤可持續發展中占據主導地位[1]。土壤微生物是土壤生態系統變化的敏感指標之一，其活性和群落結構的變化能敏感地反映出土壤生態系統的質量和健康狀況[2]。隨著城市化的發展，城市中土壤微生物的多樣性受到影響，以道路為例來說，大量的汽車尾氣排放，會對該土壤中的微生物群落造成一定的影響。長期以來純培養技術是人們對環境中的微生物進行調查研究和開發的主要方法。本研究在對土壤微生物進行純培養的基礎上，結合形態學鑒定和分子鑒定的手段來研究不同城市化程度的區域中土壤微生物多樣性的變化。

2.實驗方法與材料

2.1 土樣采集

選取嘉興市中山路為主軸從西至東分別在市區、城鄉交界處、鄉村土地共五處五點取樣法采取土樣。采樣前除去地面植被和枯枝落葉，鏟除表土，挖好深度為10-15厘米的剖面后，先取下層土樣，再取上層土樣于無菌袋中，貼上標簽用橡皮筋寬松扎口，帶回實驗室4℃冷藏。

2.2 細菌、放線菌分子鑒定

細菌、放線菌分子鑒定采用PCR-RFLP技術此技術克服了微生物培養技術的限制，能在遺傳本質的層面上對微生物群落進行較客觀的分析，較精確地揭示了微生物的種類和遺傳多樣性[3]。土樣DNA的提取及PCR擴增：用DNA母液pH 8.0(100mmol/L Tris， 100 mmol/L EDTA， 100 mmol/L磷酸鈉，1.5 mol/L NaCl， 1%CTAB)提取土樣DNA后進行凝膠電泳驗證。將DNA運用16sRNA作為通用引物進行擴增。和T載體連接：將PCR擴增產物和T-載體在T4ligase的作用下，22℃連接2h或16℃連接過夜。篩選陽性克隆：將連接后的產物，涂布與相應的抗性平板，并平板中添加IPTG和x-gal進行藍白斑篩選，挑選白色克隆，分別進行PCR驗證。酶切：將PCR驗證正確的PCR產物，采用限制性內切酶HinfⅠ，HaeⅢ酶切PCR產物；酶切產物電泳檢測最后綜合各個陽性克隆雙酶切圖譜類型，來判斷土壤中不同類型的細菌。

2.3 微生物數量測定

微生物的數量測定采用稀釋平板法[4]。稱取10g于90ml無菌水中，37℃搖床30分鐘。對搖床后的土壤樣液進行10-3～10-7系列稀釋后，取100μL涂布在倒好平板的牛肉膏蛋白胨培養基（培養細菌），高氏一號培養基（培養放線菌）和馬丁培養基（培養真菌）上。牛肉膏蛋白胨培養基平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養24h，高氏一號培養基和馬丁培養基平板倒置于28℃恒溫培養箱中培養3-5天。對每次培養后的菌落計數。挑選合適的平板計算菌落總數。土樣微生物數量計算公式：

每克干土中真菌數量=菌落數×稀釋倍數/樣土質量

2.4 真菌的鑒定

2.4.1 真菌的分離純化

將28℃恒溫培養箱培養后的真菌在操鏡臺內用接種針點樣至平板中單個培養。

2.4.2 真菌的觀察和鑒定。

將分離獲得的真菌培養一段時間后，制片顯微鏡觀察，根據菌落形態、菌絲分枝、有無孢子孢子形態和菌核特征等形態特征[6]，結合《真菌鑒定手冊》[7]鑒定真菌所屬。

2.5 真菌多樣性指數計算

運用多樣性指數(H)、Pielou均勻度指數(J)和豐富度指數(E)等，研究不同生態環境土壤真菌多樣性之間的關系[5]。

Shannon—Wiener多樣性指數：H′=-ΣPi*lnPi

Pielou均勻度指數：J = lnNi / lnN

豐富度指數：E = (S - 1) / lnN

式中，Pi = ni /N表明第i個種所占的比例，n為第i種的個體數目，N為所有物種的數目，S為物種數目。

2.6 細菌和放線菌分子鑒定

選用細菌16S rDNA通用引物分別為：5’—AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC—3’和 5’—TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C—3’。

PCR擴增 采 用20μL體 系：10×PCR buffer 2.0、10mM dNTPs 0.5μL、上 下 游引物各 10pmol、25mM MgCl22μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、模板DNA 1μL，最后加ddH2O補齊至20μL。反應條件為：95℃10min；94℃1min；40℃45s；72℃1 min30s，30個循環；72℃10min。

16S rDNA擴增產物與pUCm-T載體連接，挑選陽性克隆，再進行PCR驗證，將驗證時擴增到的16S rRNA，采用Hind Ⅲ和BsuRⅠ進行雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據酶切譜型分析，樣品中含有的優勢菌種的種數。

3.結果與分析

3.1 土壤中微生物數量分析

表1結果顯示，市區，城鄉交界，鄉村三處土樣真菌和細菌的數量逐漸減小，放線菌的數量及土樣微生物的總數卻逐漸增加。

表1 土樣細菌、真菌和放線菌數量

3.2 土樣中微生物組成的變化

結果如圖1所示， 5個土樣中細菌、放線菌和真菌的組成較為相似，表現出細菌 > 放線菌 > 真菌，但是具體各種微生物占的比例還是表現出明顯的不同。其中真菌的比例隨著城市化程度降低而表現出明顯增加，而放線菌的比例則略有減少。

圖1 各菌含量百分比圖

3.3細菌、放線菌分子鑒定結果分析

對市區、城鄉交界和鄉村的土樣中的細菌和放線菌DNA進行16sRNA擴增，酶切電泳后可探討土樣中優勢菌種的分布，結果，A1（市區）土樣經酶切電泳后有3種不同條帶，故有3種優勢菌；A3（城鄉交界）土樣有10種不同條帶，故有10種優勢菌；A4（鄉村）土樣有12種不同條帶，故有12種優勢菌，結果表明優勢菌數量市區<城鄉交界<鄉村。可見，土樣中細菌、放線菌優勢菌的數量與城市化程度成反比。

3.4 真菌多樣性分析

3.4.1 真菌種屬鑒定

本研究對5個土樣中的真菌進行鑒定，研究表明，5個土樣中的真菌共有19屬，其中A1土樣有6屬，A2土樣有5屬，A3土樣有7屬，A4，A5土樣均有8屬。5個土樣中共有的屬有：青霉屬。A1特有的屬有：刺頭束梗霉屬、梭孢霉屬。A2特有的屬有：輪枝霉屬。A3特有的屬有：單梗頭孢霉屬。A4特有的屬有：頭狀束梗霉屬、稀絲頭孢霉屬、木霉屬。A5特有的屬有：暗梗穗孢霉屬、束絲菌屬。結果表明，鄉村土樣中的真菌種屬最多，城鄉交界土樣次之，市區土樣中的真菌種屬最少。

3.4.2 真菌多樣性分析

通過對五個土樣真菌多樣性的分析，結果如表2所示。多樣性指數表現為農村>城鄉交界>市區，豐富度指數表現出農村>城鄉交界>市區。從豐富度指數和多樣性指數2項生態指數可以看出，農村土壤真菌的豐富度和多樣性明顯高于城鄉交界處土壤和市區土壤。這主要由于農村道路兩旁的土壤受污染較小，土壤中的真菌處于一種自然的生長環境下生長，受人類活動影響小。

表2 真菌多樣性指數

4.結語

第一，本研究中，不同城市化程度區域土壤中微生物的組成都表現為細菌>放線菌>真菌，這與土壤理化性質和營養條件有關。但是放線菌的比例從市區到鄉村表現出降低趨勢，真菌的比例則有明顯增加。

第二，本研究著重分析了真菌、細菌放和線菌的多樣性，結果表明真菌的豐富度指數及多樣性指數都表現為：鄉村>城鄉交界>市區，細菌、放線菌優勢菌數量：鄉村>城鄉交界>市區，推測城市化進程中人類活動會降低土壤中微生物的多樣性。