張瑞洲 鮑秀琦 韓宇鵬 姜威 陳剛 甘旭穎

【摘要】目的 探究五味苦參腸溶膠囊（Five-Flavor Sophora flavescens Enteric-Coated Capsules FSEC）對葡聚糖硫酸鈉（Dextran sodium sulfate DSS）誘導的潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis UC）模型小鼠結腸組織中miR-124/STAT3通路表達的影響。方法：取健康雄性C57BL/6小鼠30只，隨機分為空白組、模型組、FSEC組，每組10只。模型組、FSEC組飲用3%DSS水7d，空白組正常飲水7d。造模完成后，FSEC組給予3.84/kg/天濃度的五味苦參腸溶膠囊溶液灌腸7d，空白組及模型組則給與等量的生理鹽水灌腸7d。隨后，將全部小鼠切換到正常飲食，觀察各組小鼠的一般狀態，計算DAI評分。一周后處死小鼠，取結腸組織。提取RNA，實時定量PCR檢測miR-124/STAT3通路的表達水平。結果：miR-124中模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統計學差異（P<0.01），FSEC組與模型組具有顯著的統計學差異（P<0.01）。STAT3中模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統計學差異（P<0.01）、FSEC組與模型組具有統計學差異（P<0.05）。而且miR-124及STAT3的相對表達情況呈負相關。

【關鍵詞】五味苦參腸溶膠囊;潰瘍性結腸炎;miR-124/STAT3通路

【中圖分類號】R97 ? 【文獻標識碼】A ? 【文章編號】2026-5328（2021）12--02

潰瘍性結腸炎（UC）是一種慢性免疫介導的大腸炎癥，常與直腸炎癥有關，但通常向近端延伸，累及結腸的其他區域[1]。主要癥狀為持續或反復發作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急 后重和不同程度的全身癥狀[2]長期潰瘍性結腸炎也與明確的不典型增生和結直腸癌的風險有關[1]。傳統的UC口服藥物包括但不僅限于5-氨基水楊酸藥物（5-ASA），糖皮質激素，英夫利昔單抗等。但是傳統口服藥物存在療效欠佳，不良反應明顯等問題。故在UC的臨床治療中，需要尋找一種療效好，不良反應輕的口服藥物。五位苦參腸溶膠囊（FSEC）是仝戰旗【3-5】主任研制的國家新藥，現有的研究表明，傳統的中醫方法【6】治療UC的效果不亞于UC的常規臨床治療，且不良反應相較糖皮質激素等藥物小。本實驗通過檢驗FSEC對DSS誘導UC小鼠模型中miR-124/STAT3通路的影響，驗證FSEC的療效，為FSEC應用到臨床治療UC提供科學依據。

1材料及方法

1.1藥物、試劑與儀器：葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國MP公司），Hotstart HiTaq兩步法逆轉錄試劑、miRNA 第一鏈 cDNA 合成、miRNA熒光定量PCR試劑盒、TRIzol（生工生物上海），Gel-Green染料（碧云天），DNAmaker（莊盟），6*loading Buffer（takara）熒光定量PCR管（賽默飛）光學顯微鏡（日本奧林巴斯），PCR儀（美國應用生物）。

1.2實驗動物：健康成年雄性C57BL/6小鼠（30只，體重25-27克）購自遼寧長生生物技術股份有限公司

1.3實驗方法：取健康雄性C57BL/6小鼠30只，隨機分為空白組、模型組、FSEC組，每組10只。各組小鼠實驗前適應性喂養1周后，模型組、FSEC組飲用濃度為3%DSS飲用水7d，空白組正常飲水7d。造模完成后，FSEC組給予3.84/kg/天濃度的五味苦參腸溶膠囊溶液灌腸7d，空白組及模型組則給與等量的生理鹽水灌腸7d。

1.4小鼠疾病活動指數（DAI評分）：通多對小鼠有無黏液樣便、肉眼血便、重量減輕、活動度減少、毛色變差等情況進行疾病活動指數（disease activity index DAI）評分，評分標準見表1【7】，

1.5實時熒光定量PCR檢測（RT-PCR）：

①（1）取各組小鼠的結腸組織50mg，將取好的組織在液氮中用加入了1ml TRIzol的勻漿器中勻漿等RNA提取步驟獲得總RNA ，

（2）使用miRNA 第一鏈 cDNA 合成試劑盒進行合成cDNA

（3）根據試劑說明進行熒光定量的反應體系配置

（4）設定反應程序

引物序列：miR-124上游 5′- GGACTTTCTTCA TTCACACCG-3′。

miR-124下游5′- GACCACTGAGGTTAGAGCCA-3′。

用2-ΔΔCt法計算相對表達量

②取各組小鼠的結腸組織50mg，將取好的組織在液氮中用加入了1ml TRIzol的勻漿器中勻漿，后續通過Hotstart HiTaq兩步法逆轉錄試劑盒獲得最終cDNA，并根據試劑說明進行PCR擴增體系配比。引物序列如下：

STAT3 ?上游 5′-GAAGGACA TCAGCGGTAAGA-3′。

STAT3 ?下游5′-AGA TAGACCAGTGGAGACAC-3′。

反應條件95℃，10min 用2-ΔΔCt法計算相對表達量

1.6統計學方法

采用SPSS25.0和Graphpad Prism8據分析軟件進行分析，采用獨立樣本t檢驗方法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組小鼠的一般情況變化及臨床表現

空白組：小鼠一般情況良好，體重隨時間逐漸增加，無明顯稀便、黏液樣便、肉眼血便等，活動自如，毛色亮澤。

模型組：小鼠一般情況差，飲食減少，可見黏液便及肉眼血便，體重明顯減輕，活動度差，精神不佳，毛色變差，無光澤。

FSEC組：模型小鼠給予FSEC灌腸治療后，較于模型組有顯著改善，體重減輕受到控制，活動度有所恢復，雖可見稀便及偶有黏液便，但無肉眼血便。

2.2各組小鼠結腸組織中miR-124及STAT3的相對表達量

根據miR-124的相對表達量可見，模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統計學差異（P<0.01），FSEC組與模型組具有顯著的統計學差異（P<0.01）。STAT3的相對表達量，模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統計學差異（P<0.01）、FSEC組與模型組具有統計學差異（P<0.05）。而且miR-124及STAT3的相對表達情況呈負相關。

空白組（n=3） 模型組（n=3） FSEC組（n=3）

miR-124 1.00±0.08 0.68±0.15 0.81±0.16

STAT3 1.00±0.11 5.22±1.25 3.83±0.95

* P<0.05，**P<0.01

3討論

潰瘍性結腸炎（UC）是一種慢性炎癥性腸道疾病（IBD）。這些疾病在嚴重程度、頻率以及腸粘膜、先天和獲得性免疫系統以及微生物群之間的相互作用都很復雜，到目前為止還沒有確定疾病的病因。雖然治療UC的藥物有很多，包括氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫抑制劑和生物制劑，這些藥物通常對大多數患者有效，但不是所有患者都有效。而且，由于療程較長，它們的使用通常受到不良反應的限制，停用它們往往會導致疾病復發，就需要新的、更有效的療法。

MicroRNA是一種小的非編碼RNA寡核苷酸，它在轉錄后調節蛋白表達，誘導信使RNA（Mrna）降解和/或抑制與30個非翻譯區結合的靶基因的翻譯，可以調節大量基因的表達，并參與不同的人類疾病。其中MIR-124可以抑制細胞增殖和轉移，誘導細胞凋亡和氧化應激，許多炎癥性疾病及腫瘤疾病的研究中都能看到miR-124/STAT3通路的影子：比如在食道癌中MiR-124過表達顯著下調STAT3的mRNA和蛋白水平抑制疾病發展、STAT3信號通路參與了miR-124介導的對子宮內膜癌細胞的抑瘤作用。而對于UC而言，以往的研究表明IL6-STAT3信號通路在UC中的重要性，STAT3 缺乏顯著降低了干擾素 （IFN）-γ、IL-6 和 IL-17A 的產生，而 IL-10 分泌增加，表明 STAT3 可能成為潰瘍性結腸炎的治療靶點，以往的實驗驗證了miR-124對STAT3磷酸化的抑制作用最大，可以直接調節人類結腸細胞中STAT3的表達且UC活動期兒童患者miR-124表達下調導致STAT3表達上調，其相關下游靶基因VEGF、BCL2、BCLXL和MMP9表達上調。UC活動期患兒組織中miR-124的抑制歸因于STAT3啟動子區域的高甲基化。因此，靶向miR-124和STAT3可能為UC的治療提供了一種新的途徑。

本實驗結果顯示與模型組相比FSEC治療組可使miR-124表達水平上升，STAT3表達水平下降，證明FSEC可以通過影響miR-124/STAT3通路來達到治療效果，證明FSEC對UC有一定治療效果。

參考文獻：

【1】Rubin， D.T.， Ananthakrishnan， A.N.， Siegel， C.A.， Sauer， B.G.， & Long， M.D. （2019）. ACG Clinical Guideline： Ulcerative Colitis in Adults. The American Journal of Gastroenterology， 114， 384-413.

【2】吳開春，梁潔，冉志華，錢家鳴，楊紅，陳旻湖，何瑤.炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年·北京）[J].中國實用內科雜志，2018，38（09）：796-813.

【3】羅丹，高路，仝戰旗，張晨.五味苦參腸溶膠囊對潰瘍性結腸炎小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶1、白細胞介素-1β蛋白的影響[J].解放軍醫學院學報，2018，39（02）：140-143+149.

【4】羅丹，高路，仝戰旗，王世達，張亮，張晨.五味苦參腸溶膠囊對潰瘍性結腸炎小鼠炎性因子的影響[J].中華中醫藥雜志，2018，33（10）：4719-4722.

【5】羅丹. 基于NLRP3/IL-1β/IL-17信號通路探討五味苦參腸溶膠囊治療潰瘍性結腸炎的實驗研究[D].中國人民解放軍醫學院，2018.

【6】李軍祥，陳誩.潰瘍性結腸炎中西醫結合診療共識意見（2017年）[J].中國中西醫結合消化雜志，2018，26（02）：105-111+120.

【7】朱成雷，穆晶晶，徐靜雯，王琳琳，周鄭坤，鄭元林，陳才法.紫甘薯花青素對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠腸道屏障損傷的修復作用[J].中國病理生理雜志，2020，36（10）：1844-1853.

通訊作者：鮑秀琦（1963-），女，主任醫師，碩士，碩士生導師，

第一作者：張瑞洲（1995-），男，碩士生在讀

基金項目：黑龍江省衛生計生委科研課題（2019-KYYWF-1346）