姜黃素對UUO大鼠腎組織中ASK1、JNK/AP-1信號通路及Periostin蛋白表達的影響

楊麗微 康曉明 楊松

【摘要】目的：研究姜黃素對凋亡信號調節激酶1（apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1）及c-jun氨基酸末端激酶（c-junN-terminalkinase ，JNK）/轉錄因子激活蛋白-1（activatedprotein-1，AP-1）信號通路以及骨膜蛋白（Periostin）在單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠間質纖維化腎臟組織中的作用及影響。方法：將正常雄性 Wistar大鼠72只，分為假手術組，UU0組，姜黃素治療組。各組大鼠建立單側輸尿管梗阻模型，治療組（姜黃素2OOmg/ kg.d用0.9%生理鹽水溶解后2毫升灌胃）、假手術組、UU0組（僅采用等量生理鹽水灌胃）于術后3d、7d和14d，分別處死三組實驗大鼠。結果：與相應時間點空白組對比，隨UUO大鼠梗阻時間延長，腎小管間質損傷和纖維化程度加重，ASK1、JNK1、Periostin蛋白表達逐漸增加差異具有統計學意義 （ P<0.05），相較模型組治療組大鼠腎間質組織中 ASK1、JNK1、Periostin蛋白表達顯著降低差異具有統計學意義 （ P<0.05）結論：姜黃素可能通過抑制腎組織中ASK1進而影響JNK/AP-1通路的表達，影響其下游Periostin蛋白的表達量，從而改善腎間質纖維化程度。

【關鍵詞】腎臟纖維化 姜黃素 ASK1 JNK/AP-1通路 Periostin蛋白

【中圖分類號】R97 ? 【文獻標識碼】A ? 【文章編號】2026-5328（2021）12--02

腎小管間質纖維化是各種病因導致腎臟實質及間質細胞損傷后引發的最終組織學轉歸過程[1]。腎纖維化的主要病理包括炎性細胞浸潤、成纖維細胞活化和增殖，以及主要由膠原、纖連蛋白和蛋白聚糖組成的細胞外基質成分的異常增加和過度沉積[2]。此外，越來越多的證據表明細胞外基質的衍生成分可用作危險相關分子模式作為纖維化的重要促進者，只要炎癥刺激因素持續存在，這些損傷會在細胞活化和損傷階段產生并持續釋放信號，最終促進炎癥向纖維化腎臟疾病發展[3]。近年來逐漸發現姜黃素具有抗臟器纖維化的潛能，可通過不同途徑發揮抗肺纖維化、肝纖維化、心纖維化及腎纖維化作用，具體抗纖維化機制尚不明確[4]。姜黃素能夠抗氧化和清除自由基，抑腎間質纖維化，可調節UUO大鼠腎功能指標水平，改善腎組織的病理變化，進而改善腎間質纖維化和腎功能[5]。姜黃素對大鼠的保護作用與其抑制氧化應激、增強機體抗氧化能力、提高抗炎因子表達、抑制促炎因子表達有關，從而起到抑制腎間質ECM增生、基底膜增厚、腎小球硬化和腎小管間質纖維化，延緩腎功能衰竭。

1.材料與方法

1.1實驗動物及試劑

SPF ，雄性，Wistar大鼠，72只，體重約140±10g。

姜黃素，兔抗大鼠ASK1，JNK1，Periostin蛋白多克隆抗體，DAB 顯色試劑盒、免疫組化試劑盒，動物組織總RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒，實時熒光定量PCR試劑盒。

1.2方法

1.2.1實驗步驟

將正常雄性 Wistar大鼠72只，體重在15Og±1Og，分為假手術組， UU0組，姜黃素治療組。各組的大鼠建立單側輸尿管梗阻模型，應用水合氯醛 0.1g/kg，配置成1：10濃度進行灌胃，待角膜反射消失，于背部行縱切口，逐層剝離左側輸尿管，遠離腎盂1cm結扎輸尿管。假手術組只是通過游離大鼠的輸尿管，不結扎。治療組（姜黃素2OOmg/ kg.d用0.9%生理鹽水溶解后2毫升灌胃）、假手術組、UU0組（僅采用等量生理鹽水灌胃） ，手在術后3d、7d和14d結束時，分別處死三組實驗大鼠，取左側腎臟。通過蘇木精 — 伊紅染色法 和實時熒光定量-PCR檢測觀察各組實驗大鼠腎臟中的病理變化及ASK1、JNK1、Periostin蛋白和mRNA的表達變化情況。

1.2.2HE染色

各組腎組織依次脫水、透明、浸蠟及包埋，制成3μm 切片，分別行 HE 染色，觀察腎小管間質損傷和纖維化狀況。對損傷程度進行評分（TIS）。

1.2.3PCR步驟

將冷存腎組織進行均勻研磨，移入DNA-Cleaning Column管中，分次離心純化完成總RNA的提取。而后在冰上進行操作將RNA反轉錄成cDNA第一鏈，將反轉錄出的cDNA用于實時熒光定量PCR檢測。根據標準曲線，熒光定量PCR儀自動分析，計算出結果。

1.3.統計學方法

使用SP SSs25..0統計軟件對本實驗研究數據進行分析，各組別數據皆以均數±標準差（）的形式表示，組間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1HE結果分析

鏡下觀察，假手術組大鼠不同時間點腎臟整體成分，結構無明顯異常，UUO組大鼠術后第3天HE染色結構顯示腎小管官腔輕度擴張，上皮細胞出現輕度水腫，出現少量炎癥細胞浸潤。第7天，管腔結構擴張明顯，且數量增多，可見少許脫落的上皮細胞及蛋白管型，炎癥細胞滲出進一步增多;術后14天可見腎臟皮髓質層明顯萎縮變小，管腔嚴重變形，管腔表皮細胞出現壞死、脫落較重，大量炎細胞浸潤。與UUO組對應時間點相比，治療組損傷程度減輕，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖一

2.2pcr

2.3.1三組實驗大鼠ASK1 mRNA的表達

PCR結果顯示：假手術組大鼠腎組織中ASK1 mRNA的表達量較少，相較于假手術組UUO組大鼠各時間點腎組織中ASK1 mRNA表達量隨梗阻時間延長逐漸增高;與UUO組相對應的時間點ASK1 mRNA的表達對比，治療組的表達均下降，差別有統計學意義（P <0.05）。見表一

2.3.2 大鼠腎臟組織JNK1-mRNA表達的檢測

PCR結果顯示：假手術組中JNK1-mRNA少量表達，相較于假手術組UUO組各時間點JNK1-mRNA表達呈現升高趨勢，與UUO組同時間點JNK1-mRNA表達量對比，治療組表達均降低，差別有統計學意義（bP<0.05）。見表一

2.3.3大鼠腎臟組織periostin mRNA表達的檢測

PCR結果顯示：假手術組中periostin mRNA少量表達，同比假手術組UUO組各時間點periostin mRNA表達呈上升走勢，與UUO組同時間點periostin mRNA表達量對比，治療組表達均降低，差別有統計學意義（bP<0.05）。見表一

3.討 論

ASK1在各種纖維化疾病中發揮重要調節作用。腎組織活檢發現在各類纖維化腎臟疾病患者中，ASK1下游信號通路JNK活化水平在腎小球和腎小管間質中增加。有研究表明，腎損傷的修復與JNK引起的促纖維化信號有關，并且JNK可以抑制單側輸尿管梗阻的腎小管間質纖維化，其作用的發揮可能與其下游periostin蛋白的抑制有關， 當代中國中醫藥經典著作《中華本草》《中華人民共和國藥典》中都提到了姜黃素具有止痛、清心、活血、行氣、驅寒、消炎等藥用價值。近年來逐漸發現姜黃素具有抗臟器纖維化的潛能，姜黃素能夠抑制腎小管上皮細胞增殖，阻止腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉分化，并能減少EMC質成分的合成，具有干預腎間質纖維化的作用。結合本實驗研結果發現，ASK1、JNK1、periostin隨梗阻時間延長表達量逐漸增加， 論證periostin是重要的致纖維化因子，并且其致纖維化作用是通過ASK1調節JNK/AP-1通路實現的。本實驗通過姜黃素干預后更進一步證明姜黃素可影響ASK1表達，從而調節JNK/AP-1通路，干預其下游periostin對纖維化過程中間質沉積及間質轉分化的作用，從而延緩腎纖維化的進程，發揮保護腎臟的作用，本實驗發現姜黃素是治療腎臟纖維化極具潛力的藥物，但具體的作用機制有待于進一步深入研究。

參考文獻：

[1]Cybulsky A. V. Endoplasmic reticulum stress， the unfolded protein response and autophagy in kidney diseases. Nature Reviews Nephrology. 2017;13（11）：681-696.

[2]Taniguchi M.， Yoshida H. Endoplasmic reticulum stress in kidney function and disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 2017;24（4）：345-350.

[3]Dikalov S. Cross talk between mitochondria and NADPH oxidases. Free Radical Biology & Medicine. 2019;51（7）：1289-1301.

[4]宋瑋. 姜黃素對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用及機制研究 [J]. 鄭州： 鄭州大學，2014.

[5]Liang C，LiX，ZhangL，etal.T heanti fibr oticeffe ctsofmicroRNA -153 by targeting TGFBR-2 inpulmonary fibrosis[J].ExpMolPathol，2015，99（2）：279-285