HPLC法同時測定暢脈樂Ι號膠囊中3種成分的含量

陳麗艷

暢脈樂Ι號膠囊是福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由丹參、葛根、赤芍、郁金等七味中藥組成，具有滋腎活血、祛風通絡的功效，臨床上可用于腎虛血瘀證中老年腦血管硬化或中風后遺癥。原制劑的質(zhì)量標準[1]較簡單，只有芍藥苷的TLC鑒別，無含量測定項目。為控制制劑內(nèi)在質(zhì)量，本文增加采用HPLC法同時測定暢脈樂Ι號膠囊所含3種成分葛根素、芍藥苷和丹酚酸B的含量。結果表明本方法操作比較簡便，結果準確，可更好用于暢脈樂Ι號膠囊的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters e2695型 美國waters公司，含PDA檢測器)；高速離心機(TG16型 上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；超聲波清洗器(KQ-250E型 昆山市超聲儀器有限公司)；XS105DU電子天平(METTLER TOLEDO公司)；milli-Q-Reference超純水機(Millipore公司)。葛根素對照品(批號110752-201816)，芍藥苷對照品(批號110736-201842)，丹酚酸B對照品(批號111562-201917)，以上對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；暢脈樂Ι號膠囊由福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院制劑室提供(批號201912003，2020010009,202003012)；陰性樣品(不含丹參、葛根和赤芍，實驗室按處方自制)；中藥材(福州回春國藥館)；輔料(藥用規(guī)格)。CH3CN、CH3OH為色譜純；H2O為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱為Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為CH3CN (A)-CH3OH (B)-0.05% H3PO4溶液(C)，采用梯度洗脫，程序見表1；流速1.0 ml·min-1，檢測波長230 nm，柱溫25 ℃，進樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備分別精密稱取葛根素、芍藥苷、丹酚酸B對照品適量，加50% CH3OH制成每1 ml含葛根素0.6272 mg、芍藥苷0.2564 mg、丹酚酸B 0.20588 mg的混合對照品溶液，搖勻，得混合對照品母液。精密量取2 ml，置20 ml容量瓶中，加50% CH3OH定容，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備取裝量差異項下的內(nèi)容物，研細，取約0.25 g，精密稱定，置25 ml容量瓶中，加入50% CH3OH適量，超聲處理30 min，放冷，加50% CH3OH定容，離心，精密量取上清液3 ml置10 ml容量瓶中，加50% CH3OH定容，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備取陰性樣品，分別為不含丹參、葛根和赤芍的，按照上述“2.2.2”項下制備方法，分別制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗取混合對照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μl，按設定的“2.1”色譜條件進樣測定。結果陰性樣品在與供試品中葛根素、芍藥苷和丹酚酸B相同的保留時間處無干擾峰。見圖1。

1-葛根素 2-芍藥苷 3-丹酚酸B圖1 高效液相色譜圖

2.4 方法學考察①線性范圍:取混合對照品母液，精密吸取0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 ml,置20 ml容量瓶中，加50% CH3OH定容，即得系列混合對照品溶液。采用“2.1”項的色譜條件進行測定，以峰面積Y為縱坐標，濃度X(μg·ml-1)為橫坐標，計算得回歸方程。見表2。②精密度試驗: 連續(xù)6次精密吸取混合對照品溶液10 μl，依法測定，結果葛根素、芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD值分別為0.73%、0.86%和0.29%。③穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液(批號201912003)，在0 h、2 h、8 h、16 h、24 h、36 h、48 h進樣，結果暢脈樂Ι號膠囊中各峰面積的RSD值：葛根素為1.23%、芍藥苷為1.19%、丹酚酸B為1.06%，實驗結果表明該方法在實驗所需時間內(nèi)是穩(wěn)定的。④重復性試驗:取同一批號的樣品(批號201912003)，制備6份供試品溶液，分別進樣。見表3。⑤加樣回收率試驗:精密稱取已知含量的樣品(批號201912003)9份，每份約0.125 g，分別精密加入混合對照品母液2.0、4.0、6.0 ml，按 “2.2.2”方法制備溶液，依法測定。見表4。

表2 回歸方程結果

表3 重復性實驗結果(n=6)

表4 暢脈樂Ι號膠囊的加樣回收率試驗(n=9)

2.5 樣品含量測定按“2.2.2”方法制備樣品3批(批號201912003、202001009、202003012)，按“2.1”的色譜條件分別進樣測定，計算含量。見表5。

表5 含量測定結果(n=3)

2.6 測定波長經(jīng)PDA檢測器進行紫外掃描，本實驗的3個有效成分葛根素、芍藥苷和丹酚酸B的紫外吸收圖，選擇三者都有較大吸收的230 nm波長作為測定波長。見圖2。

a葛根素;b芍藥苷;c丹酚酸B圖2 紫外吸收圖

3 討論

方中主藥丹參所含的水溶性成分丹酚酸B具有抗血栓、改善血液循環(huán)、抗氧化等作用[2,3]；主藥葛根所含的活性成分葛根素具有擴張冠狀動脈、改善微循環(huán)等作用[4,5]，與丹參同用[6,7]，能顯著增強活血化瘀，改善微循環(huán)的療效。赤芍的活性成分芍藥苷,具擴張血管、改善微循環(huán)等作用[8,9]。這3種成分與暢脈樂Ι號膠囊的功效主治緊密相關，故選擇葛根素、芍藥苷和丹酚酸B作為含量測定的指標成分。

參考《中華人民共和國藥典》[10]選擇流動相CH3CN-CH3OH-0.05% H3PO4梯度洗脫，葛根素、芍藥苷和丹酚酸B峰形對稱，與其他成分峰分離良好。經(jīng)過摸索，最終確定最佳梯度洗脫條件為表1。因為丹酚酸B對熱不穩(wěn)定[11]，所以用超聲提取。進一步實驗，發(fā)現(xiàn)用50% CH3OH超聲處理，提取效果較好。考察不同時間提取(20、30、40、60 min)，發(fā)現(xiàn)只需要30 min就可把丹酚酸B提取完全；而葛根素和芍藥苷，超聲20 min就可提取完全。結合3種成分綜合考慮，最終選擇以50%CH3OH為提取溶劑，超聲30 min。