CRISPR基因編輯技術在微生物合成生物學領域的研究進展

李洋，申曉林，孫新曉，袁其朋，閆亞軍，王佳

（1北京化工大學化工資源有效利用國家重點實驗室，北京 100029，中國；2美國佐治亞大學工程學院，佐治亞州，阿森斯 30602）

進入新世紀以來，隨著科學與技術的蓬勃發展，出現了很多交叉學科。合成生物學是其中一門重要的新型交叉學科，主要涉及基因工程、系統生物學、生物化學、生物信息學、計算機科學和工程學等領域。微生物合成生物學作為合成生物學的一個重要分支，是以微生物為載體，通過改造已有微生物細胞或設計并創建新的微生物元件，使底盤生物實現其特定的生物學功能。在改造或創制這些微生物的過程中，需要對底盤生物基因組進行精簡、插入或重構，而高效精準的基因編輯技術成為解決這些問題的有效手段，為微生物合成生物學的進一步發展提供了強有力的支持。

基因編輯技術作為基因工程、代謝工程、醫學研究等領域的重要技術，一直以來都是研究熱點。傳統的基因編輯方法如同源重組，存在打靶效率低、操作時間長和操作煩瑣等問題。為了解決這些問題，陸續出現了P1 轉導技術［1］、鋅指核酶技術（zinc-finger nucleases，ZFNs）［2］、RNA 干擾技術（RNAi）［3］和轉錄激活因子效應蛋白核酸酶技術（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）［4］等。近年來，研究者們又發明了CRISPR （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技術［5］，相較于上述基因編輯技術，CRISPR 技術具有操作難度小、編輯成本低、打靶效率高、無痕編輯等優點，在微生物合成生物學領域被廣泛應用和研究，并由此開發和設計出了大量新的基因編輯元件、工具和基因線路［6］。

基于此，國內外有大量研究人員對CRISPR 基因編輯技術從發現歷史、分類［7］、作用機理［8］及在微生物基因改造領域中的應用［5，6，9，10］等方面進行了綜述。近幾年來，隨著合成生物學和代謝工程的迅猛發展，利用CRISPR 基因編輯技術創建高效的微生物細胞工廠生產特定化學品、燃料和藥品不斷取得新的突破。本文綜述了CRISPR 基因編輯技術在不同微生物合成生物學中的應用，重點介紹了應用不同技術在不同微生物中生產特定產品的最新進展，闡述了在CRISPR/Cas9 系統基礎上發展的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13 等技術的研究現狀，闡明了該技術在微生物合成生物學領域的重要性，總結并展望了該技術在微生物合成生物學領域未來的發展方向。

1 CRISPR技術發展及分類

CRISPR 技術的高速發展，歸功于無意中發現的一種未知片段。1987 年，Ishino 等［11］在大腸桿菌中發現了一段重復了5次，長度為29 bp的序列，每段重復序列被長度為32 bp 的雜亂序列隔開。2000 年，西班牙研究者Mojica 等［12］通過收集不同微生物中這種類型的重復序列，發現這種序列在微生物中廣泛存在。直到2002 年，Jansen 等［13］觀察了大量細菌和古細菌基因組后，創造了縮寫CRISPR 代表之前提到的重復序列。之后，Barrangou 等［14］證實了CRISPR 序列被用于微生物對噬菌體免疫的猜想，揭示了CRISPR 序列在微生物中的主要功能。2008 年，Brouns 等和Marraffini等［15-16］對CRISPR/Cas 系統的研究揭示了CRISPR轉錄并加工得到的crRNA（CRISPR-RNA）對DNA 具有靶向作用，因此推測CRISPR 系統具有作為基因編輯工具的潛力。2011年，Charpentier課題組發現RNA 酶Ⅲ參與crRNA 成熟前的修飾［17］，次年與Doudna 課題組合作完成單鏈嵌合RNA（single chimeric RNA）的研究［18］。2013 年，張鋒團隊實現了CRISPR/Cas9 系統在哺乳動物細胞中進行多基因編輯的功能［19］，將CRISPR技術的應用擴大化。目前為止，CRISPR 技術在微生物混合篩選方面也有相關的應用［20-23］。隨著CRISPR 系統研究得越來越深入，研究者們實現了該系統在小鼠［24］、斑馬魚［25］、線蟲［26］、擬南芥［27］、真菌［28］和細菌［29］等多種生物基因編輯中的應用。

CRISPR/Cas 系統由識別組件CRISPR 和切割組件Cas（CRISPR-associated proteins）組成。其中，識別組件CRISPR序列經過轉錄形成crRNA前體（pre-crRNA），隨后pre-crRNA 經過加工形成成熟的具有靶向識別功能的crRNA；切割組件Cas是一種核酸內切酶，可與成熟的crRNA 形成RNA-蛋白質結合體，隨著crRNA 與特定的DNA 序列特異性識別結合，Cas 切斷靶向的DNA 鏈，使基因產生缺口（double-strand breaks，DSBs），實現“打靶”；最后通過同源重組（homology-directed repair，HDR）［30］或非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）［31］等方式進行基因修復，達到基因編輯的目的。

根據Cas蛋白的結構和進化關系，CRISPR/Cas系統起初被分成3 種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型［32］。其中Ⅰ型和Ⅲ型系統的Cas蛋白均是多亞基蛋白質；而Ⅱ型系統的Cas蛋白則是單亞基蛋白質。隨著研究的深入，更多類型的CRISPR/Cas 系統被發現，如Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型，其中Ⅳ型是多亞基Cas 蛋白，Ⅴ型和Ⅵ型為單亞基Cas蛋白［33］。另外，根據Cas 蛋白功能不同，可將CRISPR/Cas 系統分為兩類：一類是由單亞基蛋白完成定點靶向和切割過程，目前該類系統僅在細菌中發現；另一類則是多亞基結構的crRNA-蛋白復合體完成crRNA 加工、靶向定位和剪切［7］，這類系統廣泛存在于古細菌及細菌中。但是多亞基的CRISPR/Cas系統較為復雜，因此在基因編輯上應用并不多，而單亞基蛋白如Cas9 蛋白［34］、Cas12a 蛋白［35］等，由于其原理簡單、操作方便等優點，應用較為廣泛。因此，本文將重點介紹CRISPR/Cas9在微生物合成生物學中的應用及研究進展。

2 CRISPR/Cas9 在微生物合成生物學中的應用

Cas9 蛋白是一種單亞基的核酸酶，是目前微生物合成生物學研究中使用的CRISPR 系統中最常用的切割組件，通常將該類系統稱為CRISPR/Cas9系統。該系統在進行基因編輯時，tracrRNA（trans-activating crRNA）、pre-crRNA 和Cas9 蛋白先被轉錄和表達出來；接著，tracrRNA 啟動RNA酶Ⅲ修飾pre-crRNA，形成成熟的crRNA；然后crRNA、tracrRNA 和Cas9 蛋白形成復合物，通過crRNA 的識別作用將復合體靶向目標DNA，與此同時，tracrRNA 激活Cas9 蛋白；接著，Cas9 發揮核酸酶的作用切割目標DNA，使其雙鏈斷裂產生DSBs［17］。產生DSBs 后，細胞可通過不同修復方式修復DNA 雙鏈（圖1）。在該系統中，crRNA 和tracrRNA 可被一種單鏈的向導RNA（single-guide RNA，sgRNA）取代，簡化識別組件RNA。為了確保復合體的成功識別，在sgRNA 的靶序列下游必須含有PAM序列（protospacer adjacent motif）［18］。PAM 是位于靶向DNA 的3′端后長度為3 bp 的序列，供sgRNA 和Cas9 蛋白復合體識別，其序列組合取決于Cas9 蛋白種類，通常為NGG［36］。CRISPR/Cas9系統通過上述過程可在微生物中實現基因的缺失、增添和替換等基因編輯操作，使微生物表現出與編輯前不同的特性，實現特定的生物學功能。微生物合成生物學的兩個最重要的目的分別是改造已有的微生物底盤細胞或創造新的底盤細胞，使其實現特定的生物功能。因此，設計和構建元件庫來改造、編輯或合成微生物底盤細胞基因組是合成生物學的重點研究內容。CRISPR 系統的開發與發展為微生物合成生物學的研究提供了一個非常簡便易操作的基因編輯技術，因此，本文將重點回顧與總結該技術在微生物合成生物學方面的研究與應用。

2.1 CRISPR-Cas9技術在大腸桿菌基因編輯中的應用進展

圖1 CRISPR/Cas9系統切割機制及修復機制圖［Cas9蛋白中藍色代表識別DNA被識別的位點，橙色代表PAM序列，深紫色代表sgRNA上的識別序列；在HDR過程中，淺紫色代表同源序列，綠色代表進行替換的序列，橙色蛋白為RecE或Redα（負責供體DNA單鏈切割），藍色蛋白為RecT或Redβ（負責黏性末端的保護以及和基因斷裂位點的結合）；在NHEJ過程中，黃色蛋白表示Ku（負責保護斷裂位點兩側），橙色蛋白為ligD（負責連接斷裂位點）］Fig.1 The cleavage and repair mechanism of CRISPR/Cas9 systems(Blue represents the recognized site of DNA,orange represents PAM sequence,and dark purple represents the recognition sequence by sgRNA.During HDR,light purple represents homologous sequences,green represents substituted sequences,orange represents RecE or Red responsible for donor DNA single strand cutting,and blue represents RecT or Red responsible for protecting sticky ends and binding to the breaking sites of genes.During NHEJ,the yellow protein represents Ku responsible for protecting the fracture site,while the orange protein is ligD responsible for connecting to the fracture site)

大腸桿菌（Escherichia coli）由于其易于培養、增殖時間短、對環境的耐受性強、基因操作容易等特點，是微生物合成生物學研究中重要的模式生物［37］。因此，在大腸桿菌中構建CRISPR/Cas9技術平臺十分重要。2013年，Jiang等［38］首先在大腸桿菌使用了CRISPR/Cas9 系統，通過Cas9 切斷目的基因，由λ-Red 蛋白修復實現目的基因的編輯，將突變序列引入宿主，證實了該系統在大腸桿菌中可有效進行基因編輯，突變率達到65%。2015 年，天津大學趙學明團隊改造了CRISPR/Cas9 系統，使其可進行迭代基因編輯，從而降低多基因編輯的循環時間，該系統同時對3個基因進行編輯的效率接近100%［39］。同年，中國科學院上海生物科學研究所楊晟團隊成功構建了一個大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯平臺，通過雙質粒系統巧妙地同時實現了基因的斷裂、重組修復和質粒的消除［40］。該團隊簡化了編輯方法，只需要替換質粒中與靶DNA識別的20 個堿基（N20），即可編輯不同的基因，而在質粒上引入多個具有特定N20結構的sgRNA 的序列即可完成多基因的編輯［40］。2016 年，Zhao等［41］通過一個質粒就實現單一基因的編輯，節省了質粒構建的時間。編輯平臺的建立在一定程度上方便了CRISPR/Cas9 技術在大腸桿菌中的應用，同時提高了編輯效率，節約了時間。但有些問題被暴露出來，如供體基因（donor DNA）長度不能太長、一次編輯的基因數量不能過多等。2016 年，為了將多個基因或大片段基因整合進大腸桿菌，Chung 等［42］通過優化實驗條件并結合λ-Red 重組蛋白和線性dsDNA，實現供體DNA 和lacZ基因的高保真替換，效率達99%，同時實現了長度分別為2.4 kb、3.9 kb、5.4 kb 和7.0 kb DNA 片段的整合，效率分別達到91%、92%、71%和61%。研究發現，隨著引入大腸桿菌基因組片段長度的增加，編輯效率逐步降低，為了進一步提高轉入長片段的基因編輯效率，2018 年，Li 等［43］采用將大片段分割成多個片段整合的方法，每輪整合只提供小同源片段，同時優化了gRNA（guide RNA）和Cas9 蛋白，成功將長度為15 kb 的大片段引入大腸桿菌基因組。在大腸桿菌基因編輯的過程中，通常需要引入HDR 系統如Red 重組系統完成對于編輯后DSB的修復，而NHEJ修復很難在原核生物中實現［44］。為了使大腸桿菌擺脫對HDR 系統的依賴，提高修復效率，有研究者將真核生物的NHEJ修復系統引入大腸桿菌。Zheng等［45］通過引入恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）的NHEJ 系統，在大腸桿菌中突變了lacZ基因，并敲除了glnALG操縱子和兩段長度分別為67 kb和123 kb的大片段DNA。為了進一步解決大腸桿菌對外源HDR 系統或NHEJ 系統的依賴，Huang 等［46］通過優化大腸桿菌天然的末端連接（ENEJ）系統，實現了83 kb以下DNA片段的缺失或失活。這些研究都有效地提高了大腸桿菌基因編輯的效率，也為CRISPR/Cas9編輯系統在大腸桿菌中的應用提供了有力保障。

微生物合成生物學一個重要目標是對已知的生命體進行基因編輯，高效合成目標產品［47］。因此，有大量的CRISPR/Cas9 系統被應用于提高目標產物生產效率的研究。天津大學研究團隊利用CRISPR/Cas9 基因編輯平臺強化EMP 途徑和β-胡蘿卜素生產相關途徑，構建了超過100種基因突變的突變文庫，最終，含有15 個修飾基因的大腸桿菌在發酵罐中生產了2.0 g/Lβ-胡蘿卜素［39］。夏軍等［48］利用楊晟團隊構建的CRISPR/Cas9 基因編輯平臺通過敲除丙酮酸羧化酶基因（ppc）、脂酰輔酶A合成酶基因（fadD）等基因，使脂肪酸產量增加了3.7%。Li 等［43］通過CRISPR/Cas9 技術將pyr操縱子、ppc和核糖磷酸焦磷酸激酶基因（prs）整合到大腸桿菌染色體中，在搖瓶中生產了5.6 g/L 尿苷。Abdelaal 等［49］敲除木糖產乙醇菌株的內源性乙醇生產基因后，引入生產正丁醇的相關基因，在大腸桿菌中生產了4.32 g/L 正丁醇。Jung 等［50］在大腸桿菌中利用CRISPR/Cas9 技術敲除了丙酮酸甲酸裂解酶（pflb）、乳酸脫氫酶（ldhA）、乙醇脫氫酶（adhE）和轉錄調節因子（fnr）的4 個編碼基因，降低副產物的生成，并過表達轉氫酶基因pntAB使聚羥基脂肪酸酯在搖瓶中產量達到32 g/L。Zhao 等［51］在原有研究基礎上用CRISPR/Cas9 技術敲除了琥珀酰輔酶A 連接酶基因（sucD），促進了己二酸合成前體琥珀酰輔酶A 的積累，使目標產物己二酸的產量達到68.0 g/L。這些研究表明，利用CRISPR/Cas9 系統對大腸桿菌進行基因編輯的技術已十分成熟。但是，大腸桿菌仍具有不耐受強酸、有機溶劑和噬菌體等缺點。因此，提高大腸桿菌對目標產物或噬菌體的耐受性可在一定程度上提高目的產物的產量或降低噬菌體污染風險。Seo 等［52］用CRISPR/Cas9 技術在大腸桿菌基因組中插入了非編碼RNA 基因（dsrA）和DNA 結合轉錄激活因子RcsB 基因（rcsB），提高了大腸桿菌對庚酸的耐受性，構建了適于生產庚酸的工程大腸桿菌。Ou 等［53］通過引入N&P 系統在宿主中表達甲酰胺酶和亞磷酸酯脫氫酶使目標大腸桿菌可以以甲酰胺和亞磷酸酯為氮源和磷源生長，同時引入CRISPR/Cas9 系統協助大腸桿菌增強抵抗T7 噬菌體攻擊的能力，開發出了耐受性較強的大腸桿菌BL21（DE3）菌株，在工業發酵中具有很大的應用潛力。綜上所述，CRISPR/Cas9技術在大腸桿菌合成生物學中的應用非常廣泛且較為成熟，但是該系統在細菌中的應用還存在脫靶率較高、編輯成功率較低、多位點同時編輯效率低且應用困難、PAM 序列依賴等問題，因此需要通過進一步的研究和開發如拓展PAM 序列、計算機輔助設計蛋白定點突變提高切割效率等，來完善和提高該技術在大腸桿菌基因編輯中的大規模應用。

2.2 CRISPR-Cas9 技術在酵母基因編輯中的應用進展

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是常用真核模式生物，不僅可以生產酒精［54］，還常常作為合成生物學和代謝工程等領域的宿主菌，生產多種高附加值化學品［55］，如青蒿素［56］等。為了滿足科學研究和工業化的需求，CRISPR/Cas9 系統在酵母菌合成生物學中的研究和應用越來越多，也日趨成熟。在sgRNA 的設計方面，已經出現了一些非常方便的工具網站，如“Yeastriction web tool”，這些工具的出現極大地方便了在釀酒酵母中進行基因編輯的操作［57］。早在2013 年，就有研究者使用90 bp 的雙鏈DNA 作為同源修復的模板，在can1位點實現100%的編輯效率［58］。2015 年，Horwitz 等［59］證明了線性化質粒與多個sgRNA 和供體DNA 的共轉化促進了大片段高效多重基因整合，并將6 個總長度為24 kb 的片段成功整合在酵母基因組中。但是，這些供體DNA同時整合的概率較低，因此有研究人員將HDR 系統引入到sgRNA 上，構建了同源整合CRISPR（homology-integrated CRISPR，HI-CRISPR）系統。利用此方法，敲除了精氨酸透性酶基因（can1）、磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶基因（ade2）、賴氨酸透性酶基因（lyp1）三個基因［60］。Ryan 等［61］將δ 肝炎病毒核糖酶與sgRNA相連以提升sgRNA 豐度，構建多重CRISPR（CRISPRm）系統，對多個位點進行敲除，編輯效率接近100%。Mans 等［57］在酵母菌中構建簡單快速的敲除平臺，使用含有兩個sgRNA 的質粒，一步轉化后可以同時引入6 個基因，促進了CRISPR/Cas9 系統在酵母中的快速、標準、高效的應用。2016 年，Shi 等［62］構建了一個新的平臺Di-CRISPR（delta-integration CRISPR-Cas），用于高效、無標記、單步、多拷貝的釀酒酵母生化途徑的整合，可整合長度高達24 kb 共計18 個拷貝的基因片段。2018 年，Bao 等［63］開發了一種CRISPR/Cas9 同源定向修復基因組工程（CHAnGE）的方法，可快速編輯基因組單核苷酸，超過98%的目標序列被成功編輯，編輯效率平均為82%，并利用該方法構建了一個突變酵母文庫。2019 年，劉子鶴團隊［64］構建了一種gRNA-tRNA 陣列CRISPR/Cas9（GTR-CRISPR）系統用于釀酒酵母的多基因編輯，該系統能以80%的敲除效率同時敲除8 個基因，極大地提高了釀酒酵母基因組的編輯效率。

這些平臺的構建，使酵母合成生物學得到快速發展，并應用于許多其他種類的工程酵母菌中。2014 年，Ryan 等［61］利用CRISPRm 系統在二倍體酵母中改良纖維二糖利用途徑，使得纖維二糖發酵速率提高10 倍以上。2015 年，Jako?iūnas 等［65］嘗試了很多基因敲除的組合，在沒有過表達甲羥戊酸（MVA）途徑相關基因的情況下，得到了比野生型菌株MVA 產量高41 倍的工程菌株。2016 年，Shi 等［62］利用Di-CRISPR 平臺構建了一個利用木糖生產（R，R）-（?）-2，3-丁二醇的酵母菌株，產量高達12.51 g/L。2017 年，Lian 等［66］提出了一種三功能CRISPR 系統組合代謝工程策略，即結合了酵母的轉錄激活、轉錄干擾和基因敲除三種功能，命名為CRISPRAID，這種策略能夠以模塊化、高通量的方式調控代謝網絡，使β-胡蘿卜素的產量提升了3 倍。同年，Apel 等［67］構建了一個基于CRISPR/Cas9 的無克隆工具包，該工具包包括了23 個Cas9-sgRNA 質粒、37 個表達強度和表達時間不同的啟動子以及10 個蛋白質定位、降解和助溶標簽，解決了酵母基因操作中選擇染色體整合位點、選擇啟動子、蛋白質定位和溶解性等問題，利用該工具優化了紫杉醇合成酶的表達，使紫杉二烯的產量提高了25 倍。2018 年，Xue等［68］通過使用CRISPR/Cas9 技術完全敲除乙醇脫氫酶基因（ADH2），使生物乙醇的產量提高了74.7%。2019 年，劉子鶴團隊通過GTR-CRISPR 平臺簡化了酵母脂質代謝網絡，將游離脂肪酸產量提高了30 倍［64］。另外，通過CRISPR/Cas9 技術對生物乙醇［68-70］、3-羥基丙酸［71］、萜類［72］和青蒿素類［73］的生物合成過程進行編輯和增強，這些物質的產量均得到了很大的提升。這些研究說明了在酵母中CRISPR/Cas9 技術的發展和應用已經非常成熟。基于此，大量高效、創新、實用的CRISPR/Cas9技術不斷被開發出來，服務于酵母合成生物學的研究與發展。

微生物合成生物學的另一個重要目標就是人工設計并合成底盤生物，元英進課題組運用CRISPR/Cas9 技術構建了人工合成釀酒酵母5 號染色體［74］，拓寬了該技術在酵母中應用的外延。另外，覃重軍課題組利用該技術將釀酒酵母天然的16 條染色體整合為一條具有完整功能的染色體SY14，并進一步利用該技術將其構建為環狀染色體［75-76］。這些研究為CRISPR/Cas9 在微生物合成生物學中的應用和發展提供了新的思路和方向，也證明了該技術在酵母中的應用效果優于在細菌中的應用，可作為一種強有力的基因編輯工具在更多的研究和實踐中大規模使用。

2.3 CRISPR-Cas9 技術在其他微生物基因編輯中的應用進展

放線菌（actinomycetes）是一類生產β-內酰胺類、四環素類、利福霉素類、氨基糖苷類、大環內酯類和糖肽類等抗生素的菌種［77］。2015 年，Cobb等［78］首次將CRISPR系統在鏈霉菌屬（Streptomycesspecies）中應用，實現了對S.lividans的雙基因同時編輯和31 kb 片段的敲除，同時構建了含sgRNA 和Cas9 相關基因的pCRISPomyces-2 溫敏型質粒，為CRISPR/Cas9 技術在鏈霉菌中的應用奠定了基礎。為了更好地服務于工業生產，在工業放線菌中CRISPR/Cas9 技術也被開發出來。2016 年，Wolf 等［79］利用該技術在游動放線菌SE50/110（Actinoplanessp.SE50/110）中敲除酪氨酸酶基因（melC2），消除副產物異黑素（different melanin）的生成，有助于提高目標產品阿卡波糖的純度。2017 年，Jia 等［80］對S.rimosus中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶同工酶基因（zwf2）和6-磷酸葡萄糖酸內酯酶基因（devB）進行突變和敲除，使土霉素產量增加了36.8%。2018年，Liu等［81］在紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）中敲除SACE_1765，并在SACE_0712 處引入pErmE 啟動子，使紅霉素產量與野生型相比提高了80.3%。另外，還可通過敲除某些基因鑒定未知的代謝途徑。例如，Low 等［82］在鏈霉菌SD85 中利用該技術敲除模塊化聚酮合酶基因（sceN），證實了該基因負責合成抗真菌多烯大環內酰胺。

絲狀真菌（filamentous fungi）是一類具有緊密基因組的真核微生物，參與一些初級代謝產物和次級代謝產物的生產，包括有機酸、酶、多糖和抗生素等，在工業和農業等領域都發揮了重要作用［83-84］。2015 年，Liu 等［85］將體外轉錄的gRNA和外源供體DNA，引入組成型表達Cas9 蛋白的里氏木霉（Trichoderma reesei）中，實現了使用CRISPR/Cas9技術的基因編輯，其中單基因編輯效率近100%，雙基因同時編輯的效率為45%，三個基因同時編輯的效率4.2%。2016 年，Pohl等［86］在產黃青霉（Penicillium chrysogenum）中實現了負責綠色素合成的兩個基因amds和pks17的突變。2017 年，Qin 等［87］首次在大型真菌靈芝（Ganoderma）中應用CRISPR/Cas9技術，有效提高了靈芝中抗癌物質靈芝酸的含量。除此之外，CRISPR/Cas9技術在其他真菌中的應用也非常廣泛，如米曲霉（Aspergillus oryzae）［88-89］、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）［90］、稻瘟菌（Pyricularia oryzae）［91］、白色念珠菌（Candida albicans）［92］、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）［28］。

噬菌體（bacteriophages）是地球上數量最多的生物，廣泛存在于地球上所有的水域中［93］。噬菌體通常有一個二十面體的頭部，在頭部的蛋白質殼里包含了一個顯性的dsDNA 基因組。除了頭部以外，大部分噬菌體都有尾巴，其作用是將基因組傳遞到宿主細菌中，以達到增殖的目的［94］。為了更好地利用噬菌體，需要對噬菌體進行基因編輯以符合特定的生物學需求。由于CRISPR 系統源于微生物對外來噬菌體抵抗，因此將CRISPR 技術用于噬菌體基因組編輯目前存在一定困難。2017 年，Tao 等［93］首次利用CRISPR/Cas9技術對T4 噬菌體進行了基因編輯，他們將CRIPSR/Cas9 質粒和供體DNA 質粒共同導入宿主大腸桿菌，成功修飾了T4 噬菌體的基因組，為噬菌體的基因編輯提供了寶貴的經驗。2019 年，Hoshiga 等［95］對T2 噬菌體的尾巴纖維進行了修飾，使T2 噬菌體對大腸桿菌O157：H7 的吸附能力與PP01 相當，對于治療由該種類大腸桿菌引起的腹瀉具有很大的意義。由上述研究可知，CRISPR/Cas9 技術在微生物合成生物學中具有廣泛而深入的應用，使底盤生物的改造更加快速、準確且高效，為微生物合成生物學的發展奠定了理論和應用基礎。因此，人們對于該技術有了更多的要求和研究，在此基礎上延伸出了更多的基因編輯技術。

3 CRISPR/Cas9 衍生技術在微生物合成生物學領域的應用

3.1 CRISPR/Cas12a（Cpf1）技術

CRISPR/Cas12a 系統屬于V 型系統，Cas12a為單亞基蛋白［96］，與Cas9 蛋白相比，該蛋白具有以下特點：①識別切割DNA 不需要tracrRNA；②PAM序列富含胸腺嘧啶，通常為TTTN；③PAM序列位于被識別的DNA 的5′端；④識別點和切割點距離PAM 較遠；⑤切割后產生黏性末端［35］；⑥蛋白分子量更小；⑦需要的crRNA 序列更短。該系統的具體作用機制如圖2（a）所示。目前，CRISPR/Cas12a 技術在常見的工業菌株如酵母［97-99］和鏈霉菌［100］中均有研究，并構建了相應的編輯平臺（表1）。如Liu 等［101］基于Cas12a 設計了一種具有基因編輯和轉錄抑制雙重功能的CRISPR 系統（RE-CRISPR），使谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）的半胱氨酸和絲氨酸產量分別提高了3.7倍和2.5倍。

藍細菌（Cyanobacteria）是一種可以進行光合作用的原核微生物，藍細菌的光合固碳和生物合成化學品是合成生物學領域研究的熱點［102］。目前主要利用同源重組方法編輯藍細菌的基因，由于其基因拷貝數較高，導致基因編輯效率極低。有相關研究表明，Cas9 蛋白對藍細菌類微生物有一定的毒性，因此使用CRISPR/Cas9 系統對其進行基因編輯更加困難［103］。2016 年，Ungerer等［104］率先實現了利用CRISPR/Cas12a 對藍細菌的基因編輯，實現了在三種不同類型的藍細菌中進行基因敲除、插入和突變的基因編輯操作。2019 年，Niu等［105］在AnabaenaPCC 7120 中利用不同抗性標記多個基因組，同時使用蔗糖敏感性質粒，使其在完成編輯后主動丟失，實現了染色體大片段DNA缺失，單基因修飾達成功率100%。由此可知，CRISPR/Cas12a 系統可以實現藍細菌的編輯基因，這些研究為CRISPR 技術在藍細菌中大規模應用奠定了理論和應用基礎。上述研究都說明CRISPR/Cas12a 編輯細胞的效率較高、特異性較高、脫靶率較低且可以編輯部分Cas9 敏感的菌種，我們可以推測其可以替代以大腸桿菌為代表的細菌中利用的CRISPR/Cas9 系統，提高細菌中基因編輯的效率和特異性。

表1 CRISPR技術在微生物合成生物學中生產目標產品的研究Tab.1 Applications of CRISPR-based technologies for the construction of microbial cell factories

3.2 CRISPR/Cas13 和Cas14

除了Cas9 和Cpf1 蛋白以外，Cas13 系列的蛋白也逐漸被重視（表2）。2016 年，張鋒團隊在細菌中發現了一種能對抗RNA 病毒的核酸酶C2c2（Cas13a），該酶能與RNA 靶向結合并裂解RNA，實現細菌自我防御［圖2（b）］。由此發展出RNA 水平上的基因編輯，可實現在DNA 不損傷的條件下對RNA 進行干擾［106］。同時，Cas13 系列中的C2c6（Cas13b）和Cas13d 也具有相同的特點［107-108］。Cas14 來源于一種古細菌的CRISPR/Cas系統，與Cas9 蛋白相比，其體積更小，且可在不要PAM 序列的情況下靶向單鏈DNA 并對其切割，具有廣泛應用的潛力［109］。目前為止，Cas13 和Cas14 在微生物合成生物學領域研究甚少，技術并不完善和成熟。但是，在RNA 水平上的編輯是可逆的、變化的，因此，可在此基礎上開發動態調控元件，調節Cas13 或Cas14 蛋白的表達量和表達時間控制通路的調節程度和調節時間，是一種非常有前景的應用方式。基于上述特點，這兩項技術未來在微生物合成生物學領域將有極大的應用和發展空間。

圖2 Cas12a和Cas13a系統作用機制［Cas12a中橙色序列為TTTN的PAM序列，Cas13a中藍色序列為PFS（Protospacer flanking site）序列］Fig.2 Working mechanism of Cas12a and Cas13a systems[Orange in Cas12a represents the PAM sequence of TTTN,and blue in Cas13a represents PFS(protospacer flanking site)sequence]

表2 CRISPR/Cas9、Cas12a、Cas13a對比總結Tab.2 The comparison and summary of CRISPR/Cas9,Cas12a and Cas13a

3.3 多亞基Cas蛋白的研究

目前，以單一亞基的Cas蛋白為核心的研究已廣泛應用于基因組編輯、轉錄調控等不同的領域，但大多數CRISPR/Cas 系統中的Cas 蛋白是多亞基的［110］。因此，這種廣泛的多亞基Cas蛋白系統在應用方面也有無窮的潛力。根據分類，多亞基的CRISPR/Cas系統包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型［33］。這些系統的Cas蛋白在發揮作用時，并非像Cas9等單一蛋白一樣，由一個亞基的不同結構域發揮不同的作用，而是由多個不同的Cas 亞基共同發揮作用［7］。2019年，Dolan等［111］在人體胚胎干細胞和HPA1細胞中引入sgRNA，實現了遠程基因敲除。該研究通過T.fusca級聯和Cas3 的RNP 傳遞獲得了13%～60%的編輯效率，表明Ⅰ型CRISPR/Cas系統在真核生物的基因組編輯和敲除方面具有潛在的用途。同年，Hidalgo-Cantabrana 等［112］利用內源性的Ⅰ型CRISPR/Cas 系統，對卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）進行了堿基缺失和插入的突變，這為重新利用內源性CRISPR系統靈活靶向和編輯基因提供了一個框架。而Ⅲ型和Ⅳ型的CRISPR/Cas系統的作用機理方面的研究已經有了突破性的進展［113-114］，但應用并不廣泛，在微生物合成生物學領域應用也很少。因此，由于多亞基Cas蛋白系統的廣泛性，其在合成生物學領域的應用還有待發掘。

4 總結和展望

CRISPR 技術的出現極大地促進了合成生物學的發展，由于其方便、快捷、高效、成本低、難度小等特點，為編輯動植物和微生物的基因組提供了強有力的工具。但是，CRISPR 技術目前還存在一定的局限性。

（1）PAM 序列的依賴性。傳統的CRISPR/Cas9 技術依賴于NGG 序列，因此無法實現對任意位點的編輯。雖然Cas12a 提供了新的PAM 依賴序列（T）TTN，在一定程度上緩解了NGG 依賴性的問題［35］，但位點依賴性并沒有被徹底解決。因此，提高CRISPR 技術的普適性依賴于研究出一種不需要PAM 序列的方法，或者通過理性設計研究識別基因高保守區堿基序列如TATA 或NTG 的方法。目前的研究已經發現了Cas14蛋白在靶向目標DNA時不需要PAM 序列［109］，因此Cas14具有解決CRISPR技術對依賴PAM序列的潛力。

（2）編輯的脫靶率。研究者們為了解決脫靶問題分別從sgRNA和Cas蛋白入手進行研究。張鋒團隊建立了gRNA-Cas9n系統，Cas9n蛋白切割時只產生一個切口，通過兩套gRNA-Cas9n 系統同時對目標基因切割，可提高sgRNA的特異性［115］，降低脫靶率。相關研究表明富含鳥嘌呤并缺乏腺嘌呤的sgRNA 更穩定，由此開展了對sgRNA 活性的研究［116］。通過大規模數據的收集并研究sgRNA 的活性，Guo等建立了一個全面的sgRNA活性圖譜，可在模式生物任何位點選擇出高活性的sgRNA 序列，有助于提高sgRNA 的特異性并降低脫靶率［117］。同樣，對Cas蛋白的改進研究較多，如使用FnCpf1［118］等，這些研究有望解決CRISPR技術脫靶率的問題。

（3）該系統的安全性控制問題。2017 年，Shin 等發現了抗CRISPR 蛋白Acr II A4 對CRISPR/Cas9 系統的抑制作用［119］，為精準控制CRISPR 系統奠定了基礎，也為控制該系統帶來了希望。

（4）應用廣泛性。雖然CRISPR 技術已經廣泛應用于多種微生物系統，但在某些微生物中依然難以應用。Cas9 蛋白對藍細菌等具有毒性，因此CRISPR 技術很難在藍細菌中應用，雖然Cas12a可以應用于藍細菌中，但是Cas9 蛋白對細胞產生毒性而Cas12a 蛋白的毒性較低的原因依然沒有較好的解釋。而這些問題和困難的不斷解決會促使CRISPR 基因編輯技術在微生物合成生物學領域具有更加廣泛的應用，從而可以快速、高效、精準地創造出更多適合生產高附加值產品的底盤生物。無論是微生物合成生物學還是CRISPR 技術都是近年來發展起來的新興學科和技術，兩者都有很多問題等待研究和解決，隨著兩者相輔相成地快速發展和深入研究，在未來一定會得到更多的研究成果和更好的技術應用。