運動發酵單胞菌底盤細胞研究現狀及展望

楊永富，耿碧男，宋皓月，何橋寧，何明雄，鮑杰，白鳳武，楊世輝

（1 湖北大學生命科學學院，省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室，湖北省環境微生物工程技術研究中心，湖北 武漢 430062；2 農業農村部沼氣科學研究所，生物質能技術研究中心，四川 成都 610041；3 華東理工大學生物工程學院，生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；4 上海交通大學生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

下一代測序（next generation sequencing，NGS）與質譜（mass spectrometry，MS）技術的發展促進了系統生物學（systems biology）方法在生命科學領域的應用，推動了在基因組層面對生物體“基因-RNA-蛋白-代謝-表型”變化規律與調控機制的深入研究［1］。在系統生物學研究的基礎上，通過引入工程學思想策略，并與現代生物學、系統科學及合成科學進行融合，使生物技術系統化和標準化，形成了在理性設計指導下重組或從頭合成新的并具有特定功能“人造生命”為目標的“合成生物學”［2-3］。同時，建立了合成生物學“設計-構建-測試-學習”（design-build-test-learn，DBTL）的研究策略，推動了通過理性或半理性改造工業微生物底盤細胞，實現“建物致知”與“建物致用”目標的研究進程。

運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是一種兼性厭氧革蘭氏陰性菌，具有許多獨特的生理特點和優異的工業生產特性，是目前唯一已知能夠在厭氧條件下利用Entner-Doudoroff（ED）途徑的微生物，具有較高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等優良特性；近年來被作為纖維素類生物質生物煉制生產生物能源的細胞工廠受到重視［4-5］，是美國能源部國家可再生能源實驗室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）及大湖生物能源研究中心（Great Lakes Bioenergy Research Center，GLBRC）研究的主要底盤細胞之一。

盡管已經利用運動發酵單胞菌開展了一系列包括生理、遺傳及代謝工程改造方面的研究，特別是拓寬了其底物利用范圍及產物生成種類，在“建物致用”的目標上取得了可喜進展，但是與模式微生物菌株相比，運動發酵單胞菌在生物元件的挖掘與定量、生物元件組裝、邏輯線路構建、代謝途徑的時空調控以及基因組編輯與優化等“建物致知”領域剛剛起步。本文簡述了運動發酵單胞菌作為潛在的細胞工廠實現工業產品生產的獨特生理特點，重點總結了其在平臺化合物、食品和藥品生產等工業領域的應用，系統介紹了運動發酵單胞菌系統生物學研究進展，同時探討了運動發酵單胞菌現有的遺傳學方法、技術與工具等方面的進展及瓶頸，以及進一步開發運動發酵單胞菌作為優良底盤細胞，推動合成生物學理論研究和實踐應用發展的研究方向。

1 運動發酵單胞菌的特性及潛在應用

1.1 獨特的生理特點

運動發酵單胞菌最初從墨西哥的龍舌蘭酒（pulque）中分離得到［6］，因其獨特的生理特性和乙醇發酵生產能力受到研究人員的重視［7］。運動發酵單胞菌培養過程具有副產物生成少、葡萄糖代謝速率快、對高濃度乙醇（體積分數16%）耐受性好、生長溫度（24～45 ℃）和pH 范圍（4.0～8.0）廣泛且“通常認為是安全的”（generally regarded as safe，GRAS）等特性［8-10］（圖1）。表型芯片研究結果表明，運動發酵單胞菌的生理特性更接近釀酒酵母而不是細菌［11］，但是與釀酒酵母相比，運動發酵單胞菌有著基因組小、對糖的轉化率及乙醇收率高等優勢［4-5］。另外，研究表明運動發酵單胞菌具有完整的Mo 固氮酶系統及生物固氮能力，可利用空氣中的氮氣作為唯一氮源生產乙醇且不影響乙醇產量，碳轉化率可達到理論最大值的97%，對該氮代謝途徑的解析有利于進一步闡明該菌的生理特征［12-13］。

運動發酵單胞菌對高乙醇或高糖的耐受性可能和其獨特的細胞膜成分相關，在其細胞膜上含有豐富的磷脂和脂肪酸，膜質中的藿烷（hopanoid）含量可高達總脂質的50%，藿烷與脂肪有助于維持細胞質膜的穩定與通透性，可能是其高乙醇耐受的原因之一［14］。在乙醇濃度上升或溫度升高時，運動發酵單胞菌細胞膜的磷脂和脂肪酸的各組分相對比例會發生變化，同時膜蛋白含量也增加，從而降低乙醇或溫度升高時對膜流動性的不良影響［15-16］。近期研究表明降低藿烷的含量或改變其極性頭部組分會降低其對乙醇的耐受，且高含量的藿烷有助于菌株對低pH 的適應，研究人員結合細菌衍生脂質體的光譜分析推測藿烷可能通過疏水作用和脂質間氫鍵相互作用來穩定脅迫環境下細菌膜的生理功能［17］。耐低pH 突變株的轉錄組數據也表明，在酸性pH 環境下，突變菌株中藿烷合成相關的基因表達量高于野生型菌株［18］，證明高含量的藿烷成分有助于突變菌株對酸性pH的耐受。

圖1 運動發酵單胞菌的重要生理特性及其多樣化的應用Fig.1 Physiological characteristics and diverse applications of Z.mobilis

另外，兼性厭氧的運動發酵單胞菌是目前已知唯一可在厭氧條件下通過ED 途徑代謝葡萄糖、果糖或蔗糖生產乙醇的微生物。通過ED 途徑，運動發酵單胞菌每代謝一分子的葡萄糖或者果糖只產生一分子的ATP，與釀酒酵母等微生物利用的Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途徑相比，等量糖代謝ATP 生成減少50%［5］。由于ATP 主要通過細胞生物量的積累而消耗，以維持胞內代謝的能量平衡，ED 途徑菌體生物量積累少，大部分碳源（>95%）被轉化為產物乙醇。同時，ED 途徑的酶占細胞總蛋白的50%左右［19-20］，并且每一個與糖降解有關的基因都高效表達，且基本都為組成型表達［21］。這種特異的糖代謝方式可能是在進化過程中為適應高糖環境而形成的，即遺失了EMP 代謝途徑中的關鍵調控酶——磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，Pfk）和三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA循環）中的2個關鍵酶，蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，Mdh）和酮戊二酸脫氫酶復合體（α-ketoglutarate dehydrogenase complex，α-KDGH）。這一快速糖代謝通路的存在，使運動發酵單胞菌可快速代謝葡萄糖，再加上高效的丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，Pdc）和乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenaseⅡ，AdhB），使其可以快速生成乙醇。

運動發酵單胞菌這種獨特的糖代謝途徑可能和其能量產生與生長部分耦聯的現象相關，即其能量的產生率和利用率之間不完全關聯。運動發酵單胞菌的呼吸鏈速率很高，比常見的模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母要高，但其生物學功能尚未完全解析［22］。目前的研究顯示運動發酵單胞菌具有一個結構性呼吸鏈，包括II 型NADH 脫氫酶（Ndh）、輔酶Q10和細胞色素BD 末端氧化酶，以及一些次要的或仍未確定的成分，呼吸鏈在有氧條件下使用氧作為末端電子受體［23］，運動發酵單胞菌是少數已知可以用NADH和NADPH作為呼吸型NADH 脫氫酶電子供體的細菌之一［24］。另外，葡萄糖和D-乳酸也可以為呼吸鏈提供電子，分別向與膜結合的葡萄糖脫氫酶和D-乳酸脫氫酶提供電子，這些電子傳遞給輔酶Q10之后，最終傳遞到能夠將氧氣還原為水的末端氧化酶［25］。同時，盡管運動發酵單胞菌中存在的F 型ATP 合成酶（FoF1-type ATPase）可以通過質子梯度產生ATP［26］，但其氧化磷酸化效率低下或不參與能量的產生。運動發酵單胞菌這種高效率電子傳遞鏈和低氧化磷酸化效率的現象，可以作為細菌中的一種呼吸鏈系統模式進行研究，揭示其低效率呼吸的原因，理解呼吸鏈組分與能量產生和胞內氧化還原平衡之間的關系［23］。

運動發酵單胞菌獨特的生理特征除有利于其在工業生產中的應用外，還有助于研究人員理解微生物底盤細胞的代謝。如運動發酵單胞菌中的EMP 途徑、TCA 循環和磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）等途徑不完整，可以通過合成生物學手段研究不同能量代謝途徑及其組合對底盤細胞代謝的影響。例如，為了驗證ATP產量對運動發酵單胞菌生物量積累的影響，研究者嘗試補全EMP 途徑［27-28］，但結果表明糖代謝受到影響、菌株生長受到抑制、且有甘油等副產物生成，分析認為可能是因為內源代謝物濃度改變使外源引入的反應反向進行［28］，這些研究為理解底盤細胞的代謝環境如何影響外源基因表達提供了指導。

1.2 廣泛的底物利用性與優良的環境適應性

野生型運動發酵單胞菌能利用的底物有限，只包括葡萄糖、果糖和蔗糖，無法利用五碳糖，如來自木質纖維素水解液中的木糖和阿拉伯糖等［5］。為了擴大其底物利用譜，研究人員通過代謝工程及實驗室適應性進化（adaptive laboratory evolution，ALE）等不同的策略做了大量的菌株改造工作。如通過引入大腸桿菌中4個與木糖代謝相關的基因xylA/B、tal和tkt，首次得到了可以利用木糖的重組菌株Z.mobilisCP4（pZB5）［29］。在此基礎上，采用類似策略通過代謝工程手段引入與阿拉伯糖代謝相關的5個基因，得到了可以利用阿拉伯糖的菌株Z.mobilisCP4（pZB206）［30］。最近一株由Z.mobilisATCC ZW658 通過適應性進化得到的突變株AD50 可以很好地共利用葡萄糖與木糖，其葡萄糖和木糖共利用時的利用速率分別為1.24 g/（g·h）和1.34 g/（g·h）（以干物質計），該突變株是目前最好的葡萄糖和木糖共利用菌株［31］。通過代謝工程手段改造運動發酵單胞菌，提高菌株對五碳糖利用的研究進展可參考此前相關的綜述文章［5，10］。

除了可以利用純糖進行乙醇發酵外，運動發酵單胞菌還可以利用多種生物質原料經過預處理與酶水解等方法釋放的單糖進行乙醇發酵［10］，如木質纖維素生物質（玉米秸稈等）、能源作物（甘蔗、甜菜、角豆、甘薯和甜高粱等）、能源植物（如柳枝稷）、工業廢料（豆粕）、食物殘渣、農業廢料（玉米芯殘渣、米糠、甜高粱秸稈、甘蔗糖蜜、竹殘渣、廢紙渣等）以及藻體生物質等［32-46］。研究運動發酵單胞菌對多種碳來源原料的利用，特別是來自工業、農業和城市廢棄物的原料，將有助于將廢棄物轉化為有價值的生物燃料或化學品，并促進其在不同領域的應用。

運動發酵單胞菌在由高糖引起的高滲條件下仍能生長，在250 g/L葡萄糖或300 g/L蔗糖條件下都能保持生長，只是會有較長的延遲期［47-48］。研究表明，運動發酵單胞菌可以在高糖環境下生長，可能與其使用無需耗能的協助擴散糖轉運系統和由葡萄糖果糖氧化還原酶（glucose-fructose oxidoreductase，Gfor）轉化果糖形成的山梨醇有關［49-50］。當細胞處于高濃度蔗糖環境中時，山梨醇在細胞周質內的積累可以高達1 mol/L，幫助降低外部高滲透壓對細胞造成的生理傷害［50］。山梨醇除了有利于細胞在由高糖引起的高滲透壓環境下生長外，還有助于運動發酵單胞菌對溫度和乙醇的耐受［47］。轉錄組學研究表明，運動發酵單胞菌培養于220 g/L 葡萄糖的高糖條件下時，細胞會通過調節與膜通道和轉運體、應激反應機制和代謝途徑相關基因的轉錄水平來實現對高濃度葡萄糖的響應［48］。

運動發酵單胞菌可以適應廣泛的pH范圍（4.0～8.0），尤其是可以在低pH 環境中生長。2019 年農業農村部成都沼氣科學研究所何明雄團隊通過多輪常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變，獲得了對乙酸耐受性增強的運動發酵單胞菌突變株AQ8-1 和AC8-9，在5.0～8.0 g/L 乙酸環境下這兩個突變株的生長和乙醇產率較野生型均有提升，且通過第3輪ARTP 誘變得到的突變株PH1-29 可以在pH 4.0或3.5 的環境下生長，而野生型菌株基本不生長［51］。通過另外一種策略ALE得到的耐低pH突變株3.5M 和3.6M，與野生型ZM4相比，在pH 3.8下的生長速度提高了50%～130%，發酵時間縮短了4～9 h，乙醇產量提高了20%～63%［18］。這些酸耐受突變菌株的獲得為直接利用酸性水解液進行乙醇發酵奠定了基礎。

運動發酵單胞菌的兼性厭氧特性為其在工業生產應用提供了便利。此外，由非絮凝菌株Z.mobilisZM4 突變而來的絮凝菌株Z.mobilisZM401 可以在生物反應器培養過程中進行自絮凝，這一特性可以使細胞在連續培養和發酵條件下不隨發酵液的排出而流失，提高細胞密度及生物反應器的乙醇生產強度，同時還可增強對抑制物的耐受性，進而降低乙醇工業化生產的成本［4，52］。上海交通大學白鳳武課題組近期研究結果表明胞外多糖——纖維素是引起ZM401絮凝的主要物質，通過基因序列比對和實驗驗證發現，引起ZM401自絮凝的主要原因是ZM401 中的纖維素合成基因bcsA（ZMO1083）的上游基因（ZMO1082）中一個胸腺嘧啶（T）的缺失，使ZM401 中的ZMO1082 與ZMO1083 融合形成了一個新基因bcsA_401，同時纖維素合成操縱子bcsABC在絮凝菌株ZM401 中的表達增高，使得纖維素合成在ZM401菌株中增加，導致細胞發生絮凝［53-54］。

運動發酵單胞菌優良的環境適應性展示了其作為工業底盤細胞的潛力，其對纖維素水解液中抑制物的耐受性也通過不同方法得到了提高。例如過表達內源NADH 氧化酶基因ZMO1885 增強了菌株的糠醛耐受性，且不引起胞內輔因子擾動［55］；過表達內源Na+/H+逆向協同轉運體基因nhaA（ZMO0119）增強了菌株對鈉離子和乙酸鈉的耐受［56-57］；通過基因組重排技術對菌株進行多輪改造，得到的重組菌株可以耐受7.0 g/L 的乙酸和3.0 g/L 的糠醛［58］。工程菌株的改造提高了運動發酵單胞菌的底物利用及產品生產的魯棒性，為其在纖維素乙醇生產中的應用奠定了基礎［59-60］。

1.3 不同工業領域的應用及研究

與釀酒酵母相比，運動發酵單胞菌細胞體積小導致比表面積高，高細胞比表面積與胞內ED 途徑共同影響下，使其葡萄糖代謝速度更快，同時ED 途徑產能水平低使生物量積累少，發酵過程乙醇對糖的表觀收率高，能耐受高濃度糖和產物乙醇。雖然野生型菌株不能利用木糖等五碳糖，而且木質纖維素水解液中的抑制物對其生長以及乙醇發酵有影響，但是通過代謝工程、合成生物學及實驗室適應性進化等手段改造，可以解決這些問題，得到性狀優良的菌株［5，60］。NREL 曾與杜邦公司（DuPont）合作，利用運動發酵單胞菌進行纖維素乙醇示范生產技術開發。目前利用運動發酵單胞菌以玉米秸稈為原料通過脫乙酰化和機械研磨處理后的水解液進行纖維素乙醇生產，乙醇濃度達到86 g/L，糖轉化率達到理論轉化率的73.3%［32，61］。運動發酵單胞菌最近還展示了作為產電菌群的潛力（2.0 mW/m2），在生產乙醇的同時生產電能［62］。

在運動發酵單胞菌中還實現了多種化合物的生物合成，包括聚羥基丁酸（polyhydroxybutyrate，PHB）、D-乳酸、2，3-丁二醇、山梨醇、乙醛、異丁醇和乳糖酸等［63-75］（表1）。其中：通過引入PHB 合成操縱子phbCAB，實現了PHB 在運動發酵單胞菌中的積累，可達0.7%的細胞干重［74］；通過異源表達優化乙酰乳酸合成酶（Als）、乙酰乳酸脫羧酶（AldC）和丁二醇脫氫酶（Bdh），實現了2，3-丁二醇在運動發酵單胞菌中的生物合成［76］，通過進一步敲除乙醇生產途徑中的丙酮酸脫羧酶（Pdc）阻斷乙醇途徑的改造，使2，3-丁二醇的濃度從10 g/L 提高到120 g/L 以上［65］；通過敲除過氧化物酶基因（cat）并過表達呼吸鏈中的NADH 脫氫酶基因（ndh），使得乙醛產量達到1.3 mol/mol（葡萄糖）［66］；通過外源引入由組成型強啟動子Pgap驅動的2-酮基異戊酸脫羧酶（KdcA），并結合由誘導型啟動子Ptet驅動的人工操縱子als-ilvC-ilvD，在運動發酵單胞菌中成功構建了異丁醇生物合成途徑，使異丁醇產量達到4.0 g/L［63］。近期，何明雄團隊通過引入外源乙烯形成酶（Efe），將運動發酵單胞菌改造為乙烯生產菌株，最高產率可達到12.83 nmol/mL（OD600）［67］。此外，多組學分析還為利用運動發酵單胞菌的甲基赤蘚糖醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑生產類異戊二烯提供了參考［25］。

表1 運動發酵單胞菌可生產的不同化合物名單Tab.1 Biochemicals produced by Z.mobilis

除了用于纖維素乙醇及平臺化合物生產，運動發酵單胞菌由于其GRAS及副產物低等優點，在食品和藥品生產等領域也開始受到重視。在食品應用中，釀酒酵母細胞壁成分被認為是可引起炎癥性腸病或克羅恩病（Crohn's disease）的抗原，這種食物過敏反應的存在使尋找酵母發酵替代菌株十分重要［77］。運動發酵單胞菌可以在發酵烘焙食品領域作為釀酒酵母的替代菌株，在對釀酒酵母具有不良反應的人群中具有潛在的應用價值。需要指出的是，野生型運動發酵單胞菌無法利用小麥面粉中的麥芽糖，因此研究人員通過在面團配方中添加運動發酵單胞菌能夠利用的蔗糖或與其他可食用微生物共發酵［78-81］，對運動發酵單胞菌在面粉發酵中糖的利用和發酵效果進行了研究。日本福山大學的Yuji 和Kenzo［79］報道了在蔗糖添加量為5 g/100 g 面粉時有較好的發酵能力，而較高的蔗糖添加量會降低發酵性能。意大利米蘭大學Picozzi 課題組也證明了在每100 g 面粉1 g 或5 g蔗糖的情況下，運動發酵單胞菌可以有效發酵面團［80］，并且研究結果表明添加蔗糖顯著提高了運動發酵單胞菌的發酵性能，產氣率和保留率分別為80%和85%，最大面團高度提高了2.6 倍，說明在添加蔗糖的情況下，運動發酵單胞菌可以有效發酵面團，從而為無酵母發酵產品領域提供了新的途徑［78］。

與異型發酵型乳酸菌（Lactobacillus sanfranciscensis）以1∶1比例共發酵，為運動發酵單胞菌無法利用麥芽糖的問題提供了另外一個策略［81］。近期意大利米蘭大學Musatti 課題組［82］利用代謝組學，對運動發酵單胞菌在發酵小麥面團時產生的主要揮發性組分等進行了測定，結果表明運動發酵單胞菌能產生傳統發酵劑類似的發酵產物，如乙醇、乙酸和4-羥基-2-丁酮（4-hydroxy-2-butanone），另外運動發酵單胞菌還能產生壬酸（nonanoic）、十一酸（undecanoic acid）、十六烯醛（2-undecanoic acid）和酒石酸二乙酯（tartaric acid diethyl ester）等，但添加NaCl 會影響發酵時間和發酵性能，該研究進一步奠定了運動發酵單胞菌在烘焙食品中應用的基礎。

近年來，利用益生元與益生菌的特性和功能造福人類健康已受到更多重視并取得了一定突破［83］，運動發酵單胞菌在這方面也有很大潛力。運動發酵單胞菌中含有的果聚糖蔗糖酶（SacB）可以被用于生成果聚糖（levan）和果寡糖（fructooligosaccharides，FOS）等功能性或保健產品。果聚糖在食品和醫用上具有多種功能，如抗腫瘤［84］、降血壓或作為益生元［85］等。FOS 也是一種益生元，它會導致胃腸道微生物群組成和/或活性發生特定變化而有益于宿主健康［86-87］。最近的研究還實現了使用果聚糖蔗糖酶來生產另一種益生元蔗果三糖（kestose），并開發了功能性產品［88］。

運動發酵單胞菌還是開菲爾酒中主要的細菌益生菌成分［89］。開菲爾酒是一種由細菌與酵母共發酵產生的低酒精度碳酸飲品，也是一種功能性保健飲品，在中國又稱為菌菇（tibicos），在一項對中國天山地區tibicos進行單分子測序的研究中也發現了運動發酵單胞菌是其中的一種主要微生物［90］。研究人員在一種大鼠模型中評價了Z.mobilisUFPEDA-202的益生菌特性和安全性，結果表明Z.mobilisUFEPEDA-202 為無致病性的安全食用菌株，且對小鼠免疫功能有一定的改善作用［91］。近期一項研究評價了定期服用運動發酵單胞菌發酵液對便秘患者腸道功能的影響，結果表明服用帶有菌群的發酵液有助于改善腸道蠕動，而服用不帶菌群的發酵液可以有效降低膽固醇和血脂的含量［92］。運動發酵單胞菌的這些特性推動了其作為益生菌的商業化生產，標準化發酵的運動發酵單胞菌原料已經用于制備藥用膠囊型益生菌［93-94］。

由于運動發酵單胞菌具有作為底盤細胞發展的優勢，在藥品開發中也得到了應用。2019 年，德國Farmako公司報道了利用運動發酵單胞菌開發的重組菌株Z.cannabinoidis?利用葡萄糖生產大麻素的研究成果，其四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）的成本約為傳統方法的千分之一，大大降低了生產大麻素的成本。與此前報道的利用酵母生產大麻素不同的是，該工藝不需要在合成大麻素后破細胞提取［95］，Z.cannabinoidis生產的產物會直接釋放到培養環境中，從而可以實現連續培養。Farmako 公司宣稱目前該工藝生產了大約180種不同的大麻素衍生物，包括大麻二酚（cannabidiol，CBD）和THC，每克Z.cannabinoidis可以產生4.5千克THC，同時900 h不間斷生產。

2 運動發酵單胞菌系統生物學研究進展

2.1 基因組序列與注釋的完成與更新

運動發酵單胞菌目前共發現3 個亞種：運動亞種（sp.mobilis）、梨亞種（sp.pomaceae）和弗朗西斯亞種（sp.francensis）。運動發酵單胞菌各亞種生存的溫度有所不同［96］，運動亞種可于24～45 ℃生存，且由于其發酵性能最佳被作為模式菌株研究。運動發酵單胞菌模式菌株ZM4（ATCC31821）的基因組于2005 年首次完成測序（圖2），其基因組由2 056 416 bp 組成，形成一個環狀染色體［97］；2009 年，利用二代測序技術和系統生物學數據對其基因組進行了修正和更為精準的基因組重注釋［98］。

隨著測序技術的發展及對ZM4 的進一步深入研究，2018 年，結合多個實驗室的研究數據對ZM4 基因組進行了再次更新，重點研究更新了4 個內源質粒信息并進行了更加準確的注釋，并探討了特定生長條件下質粒的表達水平及其與宿主環境適應性的關系［99］。目前，最新的ZM4 基因組包括一個2Mb 的環狀染色體（2 058 755bp）和4 個32～39kb 的質粒（pZM32，32 791bp；pZM33，33 006bp；pZM36，36 494bp和pZM39，39 266bp）［99］。同時，木糖利用重組菌株8b 的基因組也得到了報道，其前期改造引入的兩個木糖利用表達框被準確定位，其中Peno_talB-tktA-cat表達框插入到pZM36 質粒上，該質粒被重命名為pZM41；而Pgap_xylA-xylB-yiaB'-yiaA'-wecH'-tetA表達框插入到ZMO1237（ldhA）基因內；另外還有65 個SNPs也一同得到鑒定［99］。

圖2 運動發酵單胞菌系統與合成生物學研究進展Fig.2 Research progress of systems and synthetic biology in Z.mobilis

包括模式菌株ZM4 在內，目前運動發酵單胞菌共有29 個基因組測序項目公開，其中13 個菌株的基因組被完整測序組裝，另外還有3個菌株基因組為Scaffold 狀態，其余為Contig 狀態（數據來源于NCBI 網站）。各菌株包含2～8 個質粒不等，基因組大小在2.01～2.22Mb，部分菌株之間的進化關系及基因組之間的差異也被比較分析［5，100］。相比于模式微生物釀酒酵母（12.12Mb）和大腸桿菌（5.15Mb），運動發酵單胞菌（2.14Mb）有基因組小的優勢，便于開展基因組精簡優化及基因組合成，是一個理想的工業微生物底盤細胞。

2.2 系統生物學方法的建立及應用

基因組測序為比較基因組學的研究奠定了基礎，2005 年模式菌株ZM4 基因組測序確定時與Clusters of Orthologous Groups of proteins（COGs）數據庫中已測序的其他物種的基因組進行了比較，發現其1668 個開放讀碼框中有768 個與新鞘氨醇桿菌（Novosphingobium aromaticivorans）高度相似，這一結果與前期16S rRNA 的測序結果一致［97］。比較基因組分析，目前作為常規方法在突變菌株突變位點確定的研究中廣泛應用。

基于芯片分析的轉錄組學技術2009 年在運動發酵單胞菌中首次應用，結合代謝組學分析，開展了氧氣對運動發酵單胞菌發酵過程影響的研究［101］。研究發現在有氧與無氧條件下的差異表達基因有166 個，其中ED 途徑相關基因在穩定期的表達水平在無氧條件下高于有氧條件，同時微生物生理及代謝組學數據表明在無氧條件下生長快、糖耗快、乙醇產量高、乳酸與乙酸等副產物少，該研究首次利用轉錄組學并結合代謝組學從全局水平解釋了氧氣對運動發酵單胞菌碳代謝流及最終產物生成的影響［101］。基于芯片分析的轉錄組學研究，隨后被用于比較運動發酵單胞菌不同生長環境下的基因表達情況，如高糖環境（220 g/L 葡萄糖）、乙醇脅迫（體積分數5%或6%）、糠醛抑制及乙酸毒性等［48，102-108］，以及研究突變菌株間基因表達差異，如絮凝菌株ZM401 與非絮凝菌株的差異及乙酸耐受菌株AcR與野生型之間的差異等［53，107］（表2）。

表2 運動發酵單胞菌系統生物學研究進展總結Tab.2 Summary of systems biology research progress in Z.mobilis

續表

隨著NGS 技術的發展，基于RNA-Seq 的轉錄組學分析得以建立。與基于基因芯片的技術相比，RNA-Seq 獲得的信息更多，基因表達的線性范圍寬，偏好性更小［120］，在運動發酵單胞菌中被逐漸使用，如被用來研究質粒基因在不同條件下的表達水平、氧氣對代謝的影響、低pH 的耐受機制、氮源中鎂離子濃度對細胞生長的影響等［18，25，99，118］。近期對RNA-Seq 和基因芯片分析兩種技術在運動發酵單胞菌中進行了比較研究，對木糖利用菌株8b 在糠醛刺激與脅迫條件下的基因轉錄水平研究發現這兩種轉錄組技術之間有比較高的相關性，均能用來表征基因表達水平，但RNA-Seq 技術能提供更多轉錄本結構上的信息［105］。

蛋白質組學與代謝組學相關技術也在運動發酵單胞菌研究中建立。基于全基因組磷酸化蛋白質組研究發現幾乎所有ED 途徑的酶在有氧情況下磷酸化增加［115］，而代謝組學研究也證明了ED 途徑在運動發酵單胞菌中為熱力學有利的途徑，其比大腸桿菌或釀酒酵母中的EMP 途徑有近兩倍的熱力學優勢［114］；近期一項代謝組學研究表明，有氧培養條件下NADH/NAD+比值降低與磷酸化的糖酵解中間體濃度升高有關［119］。這些不同組學研究結果，促進了對運動發酵單胞菌在不同條件下中心代謝和細胞內氧化還原平衡機制的理解。

除了基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組分析方法單獨使用外，多組學聯合分析也被越來越多地用于對運動發酵單胞菌的研究［25，107，113-114，116，119］，如比較基因組學與轉錄組學結合研究運動發酵單胞菌中突變菌株優異表型與基因型之間的關聯。基于芯片分析的比較基因組雜交技術（comparative genome hybridization，CGH）與轉錄組學研究發現了突變菌株AcR乙酸鈉耐受的表型，ZMO0117-ZMO0119之間的1.5kb 缺失導致了Na+/H+轉運蛋白（NhaA）過表達，進而通過經典遺傳學研究將乙酸鈉耐受菌株AcR的基因型與表型關聯，為工業菌株改造及突變基因型與表型的關聯提供了范例［57］，隨后這一研究思路被用于五碳糖進化菌株以及耐酸進化菌株的基因型變化研究［18，51，112］。轉錄組、蛋白質組與代謝組等多層次組學技術聯用，解釋了Z.mobilisZM4 對6%（體積分數）乙醇脅迫反應的分子機制［103］。

目前很多的運動發酵單胞菌研究工作都聯合使用了不同的組學技術，如聯合使用轉錄組與蛋白組鑒定條件特異性基因［107］，揭示Z.mobilisZM4抗多種抑制物的潛在生物標志物［113］等。近期結合轉錄組、蛋白組和代謝組等組學技術，以類異戊二烯為目標產物，發現暴露在氧氣中會造成4-磷酸甲基赤蘚糖醇代謝途徑中鐵硫輔因子短暫的氧損傷，細胞通過代謝重構將攝取的葡萄糖的18%轉化為葡萄糖酸，并將產生的電子傳遞給電子傳遞鏈以降低氧化應激損傷的影響［25］；相同的策略也被用于揭示運動發酵單胞菌對水解液中抑制物的多種響應及影響木糖代謝的可能原因［116］。

除此之外，相關的表型分析與表型組研究也有報道。2010 年基于特制96 孔板與Biolog 系統的表型芯片分析技術在Z.mobilisZM4 中得到使用，檢測了ZM4 在2000 種不同條件下的表型，表明運動發酵單胞菌的生理特性與釀酒酵母更接近，而與通常的細菌偏離較大［11］。突變體庫適應檢測技術與表型組學研究也得以開展，美國加州大學伯克利分校Arkin 課題組通過轉座子突變構建了帶有DNA 編碼的運動發酵單胞菌突變體庫，通過后續的492 個不同實驗檢測確定了1586 個基因與水解液中的抑制物耐受相關，該結果表明89%的基因有明顯的表型［121］，為利用突變適應度對不同菌株進行功能注釋提供了藍圖［111］。另外一項研究則利用Tn10 轉座子突變體庫，分析了運動發酵單胞菌耐熱相關基因，發現耐熱性機制可能與乙醇耐受機制部分重疊，且發現運動發酵單胞菌的耐熱機制與E.coli和Arctocephalus tropicalis相似［122］。這些多組學數據以及表型相關的系統生物學數據聯合分析，有利于理解生物過程及相關機制，使系統分析運動發酵單胞菌在不同條件下關鍵基因及調控因子的表達成為可能，加快菌株代謝工程改造靶點的發現，便于對運動發酵單胞菌進行再設計與改造，強化目標產品生產，同時這些數據與技術方法也在合成生物學DBTL循環的多個環節中發揮重要作用。

2.3 代謝模型的建立與完善

多種組學技術的應用和生理生化實驗的開展積累了大量生物學信息，將數據抽象化進行數學建模是理性設計進行代謝工程改造的基礎，可以用來預測和理解生物體對設計行為的響應。代謝網絡模型的重建，尤其是基因組尺度的代謝網絡模型，可以快速實現生物體在不同條件下代謝的假設分析，探索新的科學發現，為設計改造細胞提供全新思路［123］。目前，在包括大腸桿菌和釀酒酵母等多種模式生物中，都建立了高質量的基因組尺度代謝網絡模型，得到了廣泛的應用［123-125］。

迄今為止，運動發酵單胞菌已建立了5個基于不同約束方法和條件的中小型代謝模型和4個全基因組代謝網絡模型［126-134］。此外，還有一個整合胞外代謝組學數據的全基因組代謝網絡模型在美國能源部KBase數據庫中完成，尚未公開發表。這些模型從不同角度對運動發酵單胞菌的相關生理特性進行了模擬，有助于更好地理解運動發酵單胞菌的細胞代謝，為代謝工程改造靶點提供新的設計策略和指導（表3）。

Pinto 等［135］在2008 年首先提出了運動發酵單胞菌基因組尺度代謝網絡模型構建與數據質量及整合相關的問題和解決辦法，但沒有建立最終模型。隨后韓國高級科學技術研究院Lee Sang-Yup團隊［128］首次建立了運動發酵單胞菌基因組尺度的計量學代謝網絡模型ZmoMBEL601，模擬了多種碳源的利用，進而通過基因敲除模擬，為有效生產琥珀酸提供了策略。之后又有研究者發表了兩個基因組尺度代謝網絡模型iZM363和iEM439［126-127］，其中iEM439 為電荷平衡的模型，該模型通過動態通量平衡分析，提出能量與生長不耦聯主要是因為能量用于泵出質子以維持pH［126］。韓國成均館大學Lee Dong-Yup團隊［136］基于基因組代謝網絡模型iZM411（基于iZM363 更新）分析發現，敲除pdc（pyruvate decarboxylase）、ldh（lactate dehydrogenase）和pfl（pyruvate formate lyase）基因編碼的丙酮酸消耗反應以及cl（citrate lyase）基因可使琥珀酸的摩爾產量增加15 倍，但這些基因組規模的代謝網絡模型均無可計算的模型文件，不利于交流更新。最近，伊朗德黑蘭大學Marashi和Moghimi課題組［129］基于前期已發表的基因組規模代謝網絡模型和最新的注釋、文獻信息以及生理生化數據庫，重新建立了一個更新版的基因組尺度代謝網絡模型iHN446，這一模型修正了已發表模型的錯誤，并提供了可計算的SBML 文件，為后期基因組尺度代謝網絡模型的改進奠定了基礎。

表3 運動發酵單胞菌不同尺度代謝模型Tab.3 Metabolic models at different scales established for Z.mobilis

除全基因組尺度的代謝網絡模型外，由于研究目的不同，在運動發酵單胞菌中還建立了多個不同的數學模型。美國科羅拉多大學博爾德分校Kompala 課題組［130］根據運動發酵單胞菌的酶動力學數據建立了一個小型的動力學模型，重點研究了戊糖磷酸途徑的異源酶與天然糖酵解途徑的相互作用，為運動發酵單胞菌最大化利用葡萄糖和木糖，同時最小化表達外源酶，生產乙醇提供了思路。希臘化學工程科學研究所Klapa 團隊［131］基于線性規劃（linear programming，LP）構建了一個中小型計量學模型，根據其代謝網絡的化學計量連通性，利用LP 對各種生物目標（包括能量最大化、乙醇和生物量生產率等代謝邊界）進行了分析。

雖然這些模型可以指導實驗設計，但這些簡化的模型可能忽略了其他主要代謝途徑細節而導致不太準確的預測。隨著大量的組學數據的積累及計算領域的發展，將轉錄組學等系統生物學數據整合到代謝網絡模型，構建特定環境的基因組尺度代謝網絡模型成為可能［137］。例如通過整合基因組和已發表的轉錄組數據，江南大學劉立明課題組［138］建立了光滑念珠菌（Candida glabrata）基因組規模的轉錄調控網絡，提高了光滑念珠菌的生長、代謝和基因表達對環境刺激調控行為的理解。蛋白組和代謝組等數據也可以被整合進入代謝網絡模型，大腸桿菌最新的iML1515 模型全面整合了多種組學數據，為整合系統生物學數據建立高質量代謝網絡模型提供了典范［124］。根據整合數據類型和優化的問題等因素可選擇使用不同的算法，相關的數據整合方法可參考近期綜述文章［137］。

運動發酵單胞菌研究積累了大量的系統生物學數據，這些數據資源與代謝網絡模型的整合有助于建立高質量的全基因組尺度代謝網絡模型，幫助系統理解運動發酵單胞菌相關表型現象，為代謝工程與合成生物學理性設計奠定基礎［139］。在基因組代謝網絡模型中，生物量組成方程十分關鍵，反映了參與細胞生長和維持生命所需成分的必需物質資源，一般由模擬細胞的實際物質組成決定，通常包括DNA、RNA、蛋白質、脂質和代謝所必需的小分子等［140］。通過通量平衡分析（flux balance analysis，FBA）方法模擬生長表型時，最常用的方法是使生物量目標函數（biomass objective function，BOF）反應通量最大化，以達到最好的模擬效果，而生物質組成與藥物敏感性、營養需求和某一物種工業應用的生物合成潛力密切相關，其組成在不同條件下有所不同，因此有必要在不同條件下適當調整生物量組成方程，特別是有機物輔因子［141］。前期已發表的3 個運動發酵單胞菌基因組尺度代謝網絡模型的生物量組成方程基本一致，但無法計算生成生物質。最近更新的iHN446 模型雖然生物量組成一致，但基于代謝物連通性做了一些反應更新，使得可以合成生物質［129］。在后期整合更多不同條件下的系統生物學數據、對不同條件下的細胞表型進行模擬時需要對生物量反應方程做出相應的調整，以提高整合系統生物學所建立新模型的準確性。

3 運動發酵單胞菌底盤細胞構建與合成生物學研究進展

3.1 遺傳改造

在對運動發酵單胞菌進行研究的過程中開發了多種基因組改造遺傳工具，可以分為隨機突變和理性設計兩類（圖3）。隨機突變改造屬于正向遺傳改造方法，通常包括物理誘變、化學誘變、轉座子突變（transposon mutagenesis）和ALE 等，誘變后通過篩選得到特定的突變體。希臘雅典大學Typas 課題組［142］1997 年首次發現自殺載體上的轉座因子可以用來突變運動發酵單胞菌染色體，進而成功利用微型轉座子（mini Mu transposon）構建了穩定的運動發酵單胞菌營養缺陷型。隨后其他類型的轉座子Tn5、Tn10、Tn951和Tn1725以及插入元件ISZm1068［143］也相繼被開發應用，相關進展已被綜述［9-10］。

圖3 運動發酵單胞菌中使用的遺傳改造方法及代表性結果Fig.3 Genetic engineering methods developed in Z.mobilis and representative examples

亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）、咖啡因（caffeine）和甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）等化學誘變劑在運動發酵單胞菌中廣泛應用，如高乙酸耐受菌株AcR及具有絮凝性狀的菌株ZM401 即通過NTG 誘變篩選獲得［144-145］。物理誘變方法除了常用的紫外誘變（UV）外，最近一種新型的物理誘變方法ARTP被應用于運動發酵單胞菌中，篩選出了可耐受pH 3.5的菌株PH1-29［51］。ARTP 介導的誘變具有快速、安全且更有效等優點，是傳統誘變方法的有力替代。ALE 作為提高菌株生產性狀最有效的誘變方法之一，在運動發酵單胞菌中也被廣泛應用，并且得到了大量耐受增強或魯棒性提高的菌株，例如印度理工學院Das課題組［31］通過ALE 篩選出目前葡萄糖與木糖共利用效果最好的菌株AD50，利用ALE 篩選優良菌株的進展可參閱近期綜述文章［9-10，60］。何明雄團隊［58］將基因組改組（genome shifting）技術用于運動發酵單胞菌，提高乙酸和糠醛耐受性，得到了可以耐受7 g/L乙酸和3 g/L糠醛的突變菌株。

理性設計是基于認知或從系統生物學數據學習推測而來的結論，將候選生物元件、邏輯線路和代謝途徑轉入底盤宿主細胞或直接對底盤細胞進行改造，通常會使用質粒過表達或基因編輯等方法實現。使用質粒載體進行內、外源基因的表達是最常使用且方便簡單的方法，在運動發酵單胞菌中有大量的成功案例，且相關質粒構建組裝方法如Gibson 組裝和BioBrick 組裝等也已經在運動發酵單胞菌中建立［5］。此外，通過Golden Gate方法建立了“One-POT”多片段組裝方法，該方法將含有IIS 型限制內切酶BbsI 識別和酶切序列的特異性接頭添加到啟動子Padh2、終止子Tpdc和綠色熒光蛋白基因gfp序列兩側，實現了綠色熒光蛋白表達的定向組裝并成功使綠色熒光蛋白得以表達，這一多DNA 片段無痕連接技術為在運動發酵單胞菌中多基因多途徑組裝奠定了技術基礎［146］。

同源重組是基因組編輯中基因插入失活或基因替換的常用方法，在運動發酵單胞菌中被用于構建多株基因失活的菌株，如ndh失活菌株、sacC失活菌株和限制修飾（restriction and modification，R-M）系統失活菌株等［147-150］，同時研究人員使用FLP 重組酶［151］或SacB 篩選的方法［54］消除引入的抗性基因。最近，美國威斯康星大學麥迪遜分校Kiley 課題組［152］在運動發酵單胞菌中開發了基于同源重組和質粒丟失的兩步無痕編輯技術，成功敲除了編碼乳酸脫氫酶基因（ldh）和纖維素合成酶操縱子（bcsABC），插入了鏈孢紅素操縱子，實現了無抗性基因菌株的構建。

然而，這些方法步驟較為繁雜，時間周期長，而且編輯效率不高。CRISPR-Cas 技術作為近年發展起來的高效快捷基因編輯技術，已被開發作為運動發酵單胞菌基因編輯的方法之一。2017 年四川大學譚雪梅課題組［153］將CRISPR-Cas9 引入運動發酵單胞菌，利用從化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenesCICC 10464）中克隆的Cas9 基因，構建了pSUZM2a-Cas9 質粒，結合T7 啟動子帶動表達的單鏈RNA，消除了運動發酵單胞菌中的內源質粒。近期利用鏈霉菌（Francisella novicida）中的Cas12a（Cpf1）蛋白在Z.mobilisZM4 中構建了可誘導表達Cas12a 的重組菌株，可以完成RNA 引導的雙鏈DNA 在靶位點的斷裂切割，從而建立了一種高效方便的基因組編輯工具，利用該方法做到了內源質粒消除、基因敲除、基因插入和單堿基替換，該工具還用于代謝工程，在ZM4 中建立了乳酸生物合成途徑［154］。

基于外源編輯酶的CRISPR-Cas 系統對宿主菌株具有一定的毒性，開發內源CRISPR-Cas 編輯系統是解決這一問題的有效方法。我們最近表征了Z.mobilisZM4 中內源I-F 型CRISPR-Cas 系統，建立了一種有效的基于I-F 型CRISPR-Cas 內源基因組編輯方法，實現了包括基因刪除和替換（效率為100%）、原位修飾（100%）、大片段刪除（>10kb）及同時進行多個基因編輯（18.75%）等多種基因組改造［155］，提高了運動發酵單胞菌基因編輯改造效率，為合成生物學底盤細胞的構建提供了有力的技術支撐，也為其他物種內源CRISPRCas編輯系統的建立提供了范例［156］。

運用CRISPR-Cas 技術進行基因編輯后，編輯質粒的快速消除成為一個限制多輪基因編輯的瓶頸。傳統上常用的編輯質粒消除方法是基于編輯質粒的非必需性或毒性，在無抗性培養基中連續傳代，最終得到基因編輯后編輯質粒消除的菌株，但這一方法操作煩瑣、效率低且耗時長，制約了CRISPR-Cas基因組編輯的高效、快速和連續應用。為了解決以上問題，不同的編輯質粒消除方法也在不斷嘗試完善，策略之一是將編輯質粒的復制子替換為溫敏復制子，通過溫度升高抑制溫敏復制子的復制來消除編輯質粒［157］。通過運用邏輯線路來誘導控制編輯質粒gRNA表達，也是實現編輯質粒消除的可行策略，并在其他菌株中得到了應用［158］，但目前的誘導型啟動子系統具有不同程度的滲漏，通過突變篩選更加嚴謹的誘導型啟動子或尋找新的誘導型啟動子［159］，以及建立結合轉錄與翻譯多層次調控的邏輯線路［160］，可能是實現編輯質粒快速消除的更有效策略。

3.2 多種穿梭質粒的構建與應用

作為基因工程改造的工具，質粒載體應用改變了分子生物學的發展，通過使用質粒將DNA 運輸傳遞到宿主細胞中，使外源基因直接在質粒上表達或通過同源重組整合到宿主基因組，促進了代謝工程和合成生物學的發展［161］。質粒分為廣泛宿主質粒和穿梭質粒兩大類，在運動發酵單胞菌的研究中，已經構建并不斷改進優化了多種可以在運動發酵單胞菌中使用的穿梭質粒，推動了運動發酵單胞菌研究的開展。

穿梭質粒構建最關鍵的兩點是具有在大腸桿菌和運動發酵單胞菌中復制的復制子以及合適的篩選標記。穿梭質粒通常在大腸桿菌中構建和擴增，因此經典質粒的復制子常被采用，例如pUC系列及pBR 系列質粒的復制子［162-163］。運動發酵單胞菌中復制子的尋找一直是研究重點，常用的是對各菌株染色體復制子或內源質粒復制子的克隆和嘗試，例如pSUZM1、pSUZM2和pSUZM3質粒的構建就分別采用了Z.mobilisZM4 菌株染色體和兩個內源質粒上的復制子［163］。運動發酵單胞菌中可用的篩選標記主要分為兩大類：抗性篩選和營養缺陷型篩選。由于運動發酵單胞菌對一些常用抗生素的耐受性較高，目前采用的抗生素有壯觀霉素（Spe）、四環素（Tc）、氯霉素（Cm）與卡那霉素（Km），其中Km 需要在高于200 mg/L 濃度下使用［164-165］。營養缺陷型標記篩選的代表是ZM4的泛酸營養缺陷型，由于缺乏編碼天冬氨酸脫羧酶的單一基因panD，使得該營養缺陷型菌株必須在添加有β-丙氨酸的培養基中或者異源表達panD基因的情況下才可以正常生長，這一營養缺陷型的發現有助于在運動發酵單胞菌中通過營養缺陷型標記篩選突變菌株［166］。

目前應用于運動發酵單胞菌的質粒主要有兩類來源：一種是將來源于大腸桿菌和運動發酵單胞菌的質粒進行整合，得到一個可以同時在大腸桿菌和運動發酵單胞菌復制的穿梭質粒，這樣的質粒可以在這兩種宿主中存在并繁殖［167-168］，但是這類質粒往往因為骨架太大，導致轉化效率不高，在早期研究中使用偏多［169］；另一種是基于革蘭氏陰性細菌的宿主廣泛性質粒［33，136，170-172］，這類質粒含有在革蘭氏陰性細菌內均可以識別的復制子及mob基因，可以采用接合轉化法將其轉化至運動發酵單胞菌中［57，152］，如常用的pBBR1MCS-2 質粒。近年來，根據不同研究目的，在運動發酵單胞菌中構建了一系列穿梭質粒。隨著對質粒及抗性基因研究的深入，質粒越來越小，例如目前廣泛使用的pEZ15Asp合成穿梭質粒，其骨架大小僅為3 kb，含有在大腸桿菌和運動發酵單胞菌復制的復制子，壯觀霉素抗性篩選基因以及BioBrick酶切位點［76］，方便了遺傳操作與代謝途徑構建［21，105，162，173-179］。

3.3 影響轉化效率的因素及轉化效率的提高

高效遺傳轉化方法在基因工程改造與基因組精簡改造中起著不可或缺的作用，研究人員在運動發酵單胞菌中建立了多種遺傳轉化方法，常用的是接合轉移法和電轉化法［5，180］。早在20 世紀80 年代，研究人員就開發了可以在運動發酵單胞菌中使用的接合轉移轉化法，但是該方法費時且轉化效率有菌株特異性［180-181］。2011 年上海交通大學鐘建江課題組［182］設計了一種新型載體pHW20a，將接合轉移的轉化效率提高了兩個數量級，且較之前用于接合轉移的質粒載體具有更好的穩定性及操作性。隨著電轉化技術在其他菌株中的應用，研究人員也在運動發酵單胞菌中建立了簡單方便的電轉化方法，其轉化效率在103CFU/μg量級［183］。

低轉化效率不利于重組轉化子的獲得及相關突變體文庫的構建，澳大利亞新南威爾士大學Rogers課題組［184］曾嘗試改變電轉電壓等電轉參數及電轉后的復蘇培養基與復蘇時間以提高轉化效率，但未獲成功。影響轉化效率的因素是多樣的，不同遺傳轉化技術的轉化效率不同，同一技術（如電轉化法）不同參數的選擇、感受態細胞制備的質量（如細胞收集時期、制備方法和最終細胞濃度等）以及轉化后復蘇培養基的選擇等都會帶來轉化效率的差異。山東大學張友明課題組［185］使用室溫方法制備大腸桿菌感受態細胞，發現其轉化效率比在冰上制備的感受態細胞高出10 倍，這一方法也在蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）中得到驗證［186］，說明該方法值得在包括運動發酵單胞菌在內的其他菌株中進行嘗試。此外，細胞的物理屏障如細胞壁或特殊的膜結構也可能妨礙電轉化效率，如在制作感受態細胞時使用溶菌酶處理阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）可以提高其電轉化效率［187］。運動發酵單胞菌特殊的細胞膜組分中高含量藿烷在提高其對外界環境耐受的同時，或許是影響其轉化效率的一個因素，在未來的研究中可以作為研究方向尋找轉化效率的突破，如在制備感受態細胞時嘗試降低藿烷成分等。

限制修飾R-M 系統可以保護細菌免于外來DNA 的入侵，即可以破壞外來DNA 在體內的存留［188］。對R-M 系統的破壞，特別是核酸內切酶基因的缺失，使得外源DNA 進入細胞后不會由于核酸內切酶的識別而被大量的切割而降解，從而可以改變細菌對外源DNA 的攝取能力。運動發酵單胞菌前期研究表明，對R-M 系統相應基因進行敲除會影響質粒的電轉化率［149-150］。進一步研究表明，轉化效率受到R-M 系統的影響，不僅僅是轉化方法與過程等轉化條件參數。為了防止質粒受到宿主R-M 系統的限制，Rogers 課題組［170］在Z.mobilisZM4 的轉化過程中使用I 型限制酶抑制劑，發現可以小幅度提高轉化效率，但其轉化效率仍處于103CFU/μg 量級。進一步研究發現將運動發酵單胞菌中IV 型R-M 系統編碼甲基轉移酶和限制性內切酶的基因mrr（ZMO0028）失活，可使甲基化質粒的電轉化效率提高60 倍，且不影響生長率和生物量；而使R-M 系統I 型負責識別未甲基化或錯誤甲基化DNA 的S 亞基編碼基因ZMO1933失活，可使非甲基化質粒的電轉化效率提高30 倍，但會影響細胞生長［150］。何明雄團隊［149］的研究結果表明，在突變株Zmmrr和Zm1933中，甲基化穿梭質粒pBBR1MCS-tet 的電轉化率分別提高了17 倍和2 倍。白鳳武課題組［54］在ZM4 與絮凝菌株ZM401 中實現了ZMO0028和ZMO1933的雙敲除，使得甲基化和非甲基化質粒pHW20a 的電轉化效率均大幅提升，且雙敲除菌株的生長與乙醇生成以及ZM401 的絮凝性能未受影響。

這些研究結果之間可能因為使用的質粒大小與濃度不同存在一些差異，但可以確定的是運動發酵單胞菌中R-M 系統會影響甲基化與非甲基化外源質粒的電轉化效率，可以通過控制內源R-M 系統或者外源DNA 甲基化狀態提高轉化率。另外值得一提的是，我們在研究Z.mobilisZM4 內源CRISPR-Cas 系統的過程中發現，用pEZ15Asp 載體轉化ZMO0028基因敲除菌株ΔZMO0028時，轉化效率為野生型菌株的90 倍，同時在ΔZMO0028的背景下所有基因組編輯操作的效率都得到了顯著提高，單基因敲除的編輯效率均達到100%（16/16），而大于10 kb 片段敲除的編輯效率從12.5%（2/16）提高到50%（8/16），表明R-M 系統可能不僅影響外源DNA 的轉化效率，而且影響CRISPR-Cas 技術相關的編輯效率［155］。

3.4 生物元件的預測與鑒定

在合成生物學的“設計”和“構建”環節中，編碼和非編碼區域的模塊化生物元件信息是生物系統設計的重要基礎。在運動發酵單胞菌中，前期通過經典的分子生物學方法研究確定了一些啟動子［180］。基因組序列的發表以及大量系統生物學數據的積累為生物功能與調控元件的挖掘及鑒定奠定了基礎［5，60］。sRNA 作為一種反式作用元件，在基因表達的多個過程中發揮作用，如細胞在氧化應激、乙醇、溫度或pH 變化等脅迫條件下調節多種代謝途徑［189］。美國得克薩斯大學奧斯汀分校Contreras 課題組［110］通過sRNA 轉錄組學及計算機預測分析，發現了運動發酵單胞菌15 個新的sRNA，并且通過實驗研究表明其中Zms2、Zms6和Zms18 與調節應對乙醇脅迫相關。該課題組［190］也通過高通量測序技術探索sRNA 可能的作用機制，結合已有轉錄組學數據，開發了運動發酵單胞菌REFINE（RNA-seq examiner for phenotype-informed network engineering）系統，為理解sRNA與其他生物元件之間的關系與作用機制及其在代謝工程實踐中的應用提供了有效工具。

轉錄本內的5'UTR 可以在各種生物體中參與mRNA 表達水平的調控，以應對各種代謝物或環境條件變化，例如sRNA 會與目標基因的5'UTR相作用，調控下游基因的表達［191］。Contreras 團隊與作者課題組合作，利用生物信息學手段對轉錄組數據進行分析，發現了運動發酵單胞菌中36 個5'UTR 可能與乙醇、乙酸或木糖脅迫相關，其中UTR_ZMO0347 被證明可調控其下游基因hfq的表達，使其在乙醇脅迫條件下的表達下調［192］，這一結果為研究運動發酵單胞菌在脅迫環境下細胞響應調控網絡提供了新的思路。進一步研究揭示了運動發酵單胞菌中sRNA-sRNA 及sRNAprotein 之間相互作用的調控網絡，解析了兩個影響乙醇生成sRNA（Zms4 和Zms6）的共調控網絡［117］。該研究在運動發酵單胞菌中首次揭示了sRNA 作用網絡，通過一組不同的mRNA 靶點和大量的sRNA 協同，調控多個參與乙醇代謝相關的通路。

最近，基于系統生物學數據及雙熒光報告基因系統對運動單胞菌進行生物元件預測、篩選與鑒定的策略得以建立。通過流式細胞儀檢測包括EGFP、mCherry和RFP等5 種報告基因的熒光強度，建立了基于流式細胞術的雙熒光報告基因系統：該系統含有EGFP和opmCherry兩個報告基因，其中EGFP用以表征待測的調控元件，opmCherry作為內參以消除內外噪聲；利用該系統進一步表征了基于系統生物學數據預測和生物信息學方法分析預測的38 個啟動子和4 個核糖體結合位點（ribosome binding site，RBS）的強度，實驗結果與系統生物學預測的相關性較高［21］。與早期著眼于重要功能基因啟動子的研究［193］不同的是，基于系統生物學數據可以預測篩選不同強度的啟動子，供不同的需要使用。這一研究為利用系統生物學數據篩選潛在調控元件以及使用雙熒光報告基因系統定量鑒定調控元件提供了新的策略與方法，我們利用這一策略篩選鑒定了3個內源乙醇誘導性啟動子［159］。此外，雙熒光報告基因系統還被用于表征sRNA 與靶基因5'UTR 之間的相互作用［117］。

美國威斯康星大學麥迪遜分校Landick 課題組［194］近期利用RNA-Seq、TSS-Seq、Term-Seq與Ribo-Seq 等多組學技術系統鑒定了運動發酵單胞菌轉錄起始位點和轉錄終止位點，并分析確定了運動發酵單胞菌中σA啟動子?10 和?35 區域的保守序列為TANNNN 和TTGNNN。與大腸桿菌的?10 區域保守序列相比，運動發酵單胞菌的?10 區域缺少在大腸桿菌中的T-7位點，這與新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）相似，說明大腸桿菌?10 區域的T-7位點不具有普遍性。這些轉錄調控系統研究結果可結合雙熒光報告基因系統，定量化鑒定運動發酵單胞菌非編碼區域的相關生物調控元件與邏輯線路，增加可用于合成生物學研究的生物元件與邏輯線路的種類與數量，推動運動發酵單胞菌在合成生物學領域的進一步發展。

4 運動發酵單胞菌底盤細胞構建展望

4.1 底盤細胞構建

運動發酵單胞菌具有基因組小、遺傳操作工具基本完備、安全性高、環境脅迫耐受性強及副產物低等特點，已作為底盤細胞用于開發包括纖維素乙醇在內的多種平臺化合物的生產（圖1，表1）。碳、氮作為地球生物化學循環的重要組成部分，也與地球的能源與環境相關，利用生物進行碳、氮的固定具有重要意義。

運動發酵單胞菌具有完整的Mo 固氮酶系統，可以利用氮氣為唯一氮源生長并發酵生產乙醇［12-13］。天然生物固氮過程受到復雜的調控作用，并且進化出了獨特的氧保護機制，雖然目前關于固氮的合成生物學有了一定的進展，但還屬于理論探索階段［195］。我們在開發運動發酵單胞菌內源I-F 型CRISPR-Cas 系統時成功敲除了固氮基因簇中的10kb 基因組片段（ZMO1815-ZMO1822），敲除菌株生長未受到明顯影響［155］。美國威斯康星大學麥迪遜分校Amador-Noguez 課題組［115］提出了運動發酵單胞菌可能的固氮調控機制，為固氮調控的研究奠定了理論基礎。利用運動發酵單胞菌基因組小及遺傳操作系統成熟等優勢，將其作為底盤細胞推進固氮系統中氧保護機制、固氮基因簇簡化、固氮相關催化元件和調控元件的挖掘與鑒定等固氮合成生物學的研究，是未來值得拓展的研究方向之一。

在運動發酵單胞菌能夠固氮的前提下，引入外源的固碳途徑，將有可能實現氮氣和二氧化碳的共同利用，利用合成生物學的手段創造出一種目前自然界尚不多見的可同時固定碳、氮的微生物。過去50 年，人類活動使大氣中CO2的濃度從300 μL/L 以下上升到了413 μL/L，預計到2045 年會上升至500 μL/L［196］。CO2濃度的不斷升高，將使全球溫度上升，導致冰山和積雪的融化，從而引起海平面的上升，嚴重影響全球氣候和環境。利用生物固定CO2進行生物能源的生產或綠色生物制造，有利于降低大氣中CO2濃度及由此帶來的各種不利影響。最近以色列魏茨曼科學研究院的Milo 研究團隊［197］通過外源引入卡爾文循環中的Rubisco 酶同時共表達磷酸核酮糖激酶（phosphoribulokinase，Prk）對大腸桿菌進行改造，并通過實驗室進化使其可以利用CO2為唯一碳源。藍藻中固碳羧化體相關基因及蛋白結構的確定，使其得以在大腸桿菌中實現人工合成，也為固定二氧化碳提供了另一種思路［198-200］。北京化工大學譚天偉教授課題組［201］提出了基于CO2為底物，進行第三代生物煉制的綠色生物制造概念，系統分析了目前生物CO2固定途徑和細胞能源供應新模式的兩大關鍵問題，為細胞工廠工程化改造提出了前瞻性的指導意見。

運動發酵單胞菌本身擁有完整的固氮基因簇，利用內、外源CRISPR-Cas 基因編輯技術以及雙熒光報告基因生物元件鑒定系統等研究工具將運動發酵單胞菌作為底盤細胞進行改造，使其利用二氧化碳和氮氣生產目標化合物有很大的潛力（圖4）。需要指出的是，碳、氮的固定都是高耗能的生物過程，而運動發酵單胞菌的氧化磷酸化產能效率較低，在此過程中，能量的供應將是一個具有挑戰性的難點。

圖4 運動發酵單胞菌底盤細胞構建展望Fig.4 Perspectives on developing Z.mobilis as a chassis cell

4.2 CRISPR-Cas技術的發展

CRISPR-Cas 技術可以快速實現基因組的編輯，是目前廣泛使用的高效基因組編輯技術。2017 年美國科羅拉多大學博爾德分校Gill 課題組［202］開發了CREATE（CRISPR-enabled trackable genome engineering）技術，可實現對基因組上多基因和多位點的同時編輯，且便于追溯和追蹤基因型與表型的關系，進一步提升了編輯效率。天津大學王智文課題組［203］將CREATE 技術用于編輯改造大腸桿菌全局調控因子，并與轉錄組分析結合研究大腸桿菌的耐藥性。這些研究展現了CRISPR-Cas 技術多基因同時編輯的能力，但由于CRISPR-Cas 技術可編輯位點受到PAM 位點的限制，制約了基因組編輯位點的選擇。近期報道的兩種人工改造的Cas 酶（SpG 和SpRY）中的SpRY幾乎可以不受PAM 位點序列限制進行編輯，這一突破極大擴展了CRISPR-Cas 系統的編輯能力，同時也為其他類型CRISPR-Cas 系統的改造提供了良好的思路［204］。利用編碼在轉座子中的CRISPR-Cas系統，研究人員實現了高效特異的DNA 片段插入，為利用CRISPR-Cas 技術的基因插入操作提供了又一高效解決方案［205-206］。

基于CRISPR-Cas 開發的多種CRISPRi/a 基因沉默或激活方法也被廣泛使用。湖北大學張桂敏課題組［207］在枯草芽孢桿菌中建立了dCas9-α/ω 系統，通過設計位點特異性gRNA可實現同時激活和抑制不同基因的表達，展現了CRISPR-Cas 技術多基因、多方向和多維度同時精準調節基因表達的強大能力，為其在其他物種中的擴展應用提供了借鑒。除了作為基因表達調控的工具，CRISPRCas 還可以用來進行基因組尺度的基因型鑒定［208］。清華大學邢新會和張翀課題組［209］建立了基于CRISPRi的全基因組高通量基因功能研究技術，該技術通過建立全基因組gRNA文庫，高效研究包括轉錄非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在內全基因組所有基因的功能。Arkin 課題組［210］最近發表的預印本研究表明，通過構建一個緊湊和全面的CRISPRi 文庫（約33 000 個sgRNA），可覆蓋基因組的所有元件，包括蛋白編碼基因、ncRNA、啟動子和轉錄因子結合位點等。天津大學宋浩課題組［211］最新發表的預印本將CRISPRi與組學分析相結合，確定在多個細胞過程中起作用的潛在目標基因，提升E.coli中脂肪酸的產量，對得到的56 個有益基因進行組合改造，使得脂肪酸最終發酵產量達到21.6 g/L，為目前E.coli重組菌株中最高。

這些基于CRISPR-Cas 發展起來的技術方法，與系統生物學或高通量檢測等其他技術結合后，如CREATE 與轉錄組學的結合［203］，會進一步釋放其強大的功能，是將來菌株改造的發展方向。目前運動發酵單胞菌中的內、外源CRISPR-Cas 技術均已建立［153-155］，尤其是內源系統的建立會減少外源編輯酶對細胞的毒性，實現快速的基因編輯，目前已有少量相關研究開展［156］。但是，內源系統較為復雜，發揮作用時需要多個相關蛋白的輔助作用，可能會影響基于內源系統的CRISPRa/i或單堿基編輯工具的開發，所以應借鑒以上優秀應用實例，同時利用內源和外源CRISPR-Cas 體系開發完善運動發酵單胞菌基因編輯工具，為CRISPR-Cas 技術在運動發酵單胞菌中的進一步應用提供可能。

4.3 高效篩選平臺的建立與應用

合成生物學細胞工廠設計研究過程中會有大量中間突變體產生，快速高效分選到理想菌株十分關鍵。傳統篩選方法往往以目標代謝物為主，通量低、效率低、費時、費力且昂貴。高通量或自動化篩選平臺與檢測技術的建立，可以顯著提升工作效率，減少人為誤差，提高準確性。目前，已在運動發酵單胞菌中建立了基于Bioscreen C 的微量生長檢測系統，可同時鑒定200種不同條件對菌株生長的影響［212］；基于Biolog 表型芯片技術可快速進行表型鑒定，一次最多可同時進行48 塊96孔板的鑒定［11］。此外，基于微流控的微生物液滴培養儀（microbial microdroplet culture system，MMC）全自動傳代篩選技術也在運動發酵單胞菌中建立，可用于改造后優勢菌株的快速自動化進化篩選［213］。

除了基于細胞生長等表型進行篩選的技術外，近年來，基于生物傳感的高通量篩選技術也被廣泛開發利用，美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校趙惠民課題組［214］利用關鍵代謝物水平轉換為熒光信號的遺傳傳感器，應用釀酒酵母中的丙二酰輔酶A 傳感器FapR 及其相應的操縱子fapO，監測活細胞內丙二酰輔酶A 的水平，為酵母的高通量遺傳篩選提供了有效的工具。江南大學李江華和張娟課題組［215］利用赤蘚糖醇反應性轉錄因子EryD，在解脂耶氏酵母構建了能夠在動態范圍特異性響應的傳感器-調節器系統，用于快速篩選和鑒定突變體文庫，構建了基于生物傳感的赤蘚糖醇高通量篩選方法。上海交通大學馮雁和楊廣宇課題組［216］利用細胞膜表面半乳糖透酶（LacY）對底物及糖基化產物通透性的差異建立了首個針對巖藻糖基化酶的單細胞超高通量篩選技術平臺。這些基于生物傳感器的高通量篩選方法是目前在運動發酵單胞菌中所缺乏的，相關方法的建立可廣泛用于運動發酵單胞菌突變體和遺傳文庫的篩選、微生物生理學研究、發酵條件優化和系統生物學研究，加快生物元件、邏輯線路、代謝途徑及細胞工廠性能的檢測鑒定。

單細胞精度的快速分選也是高通量篩選平臺的重要構成［217］。基于流式細胞術的熒光激活細胞分選（fluorescence-activated cell sorting，FACS）技術在微生物代謝工程中應用較多，但由于技術限制，利用FACS 進行細胞分選的結果尚存在較高的背景噪聲，尤其是應用于細胞大小為10 μm 以下的原核細胞時，無法高效實現高精度的單細胞分選，往往需要在分選后再次通過孔板或平板篩選。另外，FACS 技術只能根據細胞內或細胞表面的熒光信號進行分選，不能根據胞外物質進行分選。基于微流控技術的熒光激活液滴分選系統（fluorescence activated droplet sorting system，FADS）則可以根據胞外分泌物進行分選，并方便與其他檢測技術整合［218］。

中國科學院青島生物能源與過程所徐健團隊通過耦合單細胞拉曼光譜和液滴微流控技術，開發了拉曼激活單細胞液滴分選技術（Ramanactivated single-cell droplet sorting，RADS），該技術能夠在在無標記、無損傷的前提下進行單細胞精度的分選。以生產蝦青素的雨生紅球藻為研究對象，篩選通量可以達260 個細胞/min，分選準確率高達98.3%，且分選出來的細胞92.7%能夠正常分裂增殖［219］。近期，該團隊基于自主研發的介電單細胞捕獲/釋放的拉曼激活液滴分選技術pDEPRADS研制了高通量流式拉曼分選儀FlowRACS，可以實現基于分子光譜、非標記式、單細胞精度、高通量流式的酶活篩選［220］。該團隊近期還開發了一種高覆蓋度的單細胞拉曼分選測序技術（Ramanactivated gravity-driven single-cell encapsulation and sequencing，RAGE-Seq），可實現對單個細菌細胞的分選與測序，覆蓋度>95%，意味著可以將單個細菌細胞的高覆蓋度基因與代謝表型直接關聯，為細菌單細胞水平的基因型與表型的關聯提供了技術支持［221］。另一個值得關注的是使用光激活細胞成像和分類技術的伯克利之光（Berkeley Lights‘Beacon’）。細胞在該系統中被隔離培養在體積為皮升的納米流體設備“筆”上用于生長和分析，每個芯片包含多達14 000 支“筆”，其中容納了許多單細胞或菌落，通過熒光定量產物及標準光學技術進行細胞計數，該技術可以在納米流體設備上對單細胞進行克隆分離、細胞選擇和適當的細胞編輯等操作［222］。

包括運動發酵單胞菌在內的原核生物，對單細胞精度分選的要求更高，以上這些高通量自動化技術的擴展應用，特別是單細胞精度的細胞分選及基于生物傳感的高通量篩選在運動發酵單胞菌中的應用，將大大提升運動發酵單胞菌候選菌株的分離篩選效率，推動運動發酵單胞菌高效篩選平臺的建立以及在單細胞水平的研究。

4.4 精準代謝調控的建立

原核生物中有多種精細調控機制，保證其對環境良好的適應性，包括基因水平、轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平調控等。在傳統的代謝工程應用中，以使用啟動子在轉錄水平和RBS 在翻譯水平的調控居多，即使用特定強度的啟動子或RBS 對特定的基因進行調控。最近，研究人員提出了在翻譯層面新的調控機制。江南大學陳堅課題組［223］通過改變基因N 端編碼序列的45 bp 堿基以調控基因的翻譯起始效率，應用于N-乙酰神經氨酸（N-acetyl-neuraminic acid，NeuAc）的合成調控，成功將NeuAc 的產量提高了3.21 倍。中國科學院天津工業生物技術研究所張學禮團隊［224］首次提出了一種利用起始密碼子組合調控（combinatorial modulation of initial codons，CMIC）的新策略，在翻譯層面調節優化代謝途徑，將其應用于大腸桿菌中玉米黃素合成途徑的3 個基因crtZ、crtY和crtI，得到一株玉米黃素產量為出發菌株10倍的重組菌株，CMIC策略只需改變3 bp的序列，將縮小庫容量，從而減小工作量和縮短實驗時間。

以上這類代謝調控一般稱為靜態調控，即無需感知細胞內外的環境，直接使用組成型元件對調控基因進行過表達或抑制，甚至還可以直接敲除，但這一過程可能會造成胞內穩態環境的破壞，且無法對細胞內外環境的改變作出即時的響應，因此研究人員開發了動態調控策略，即通過感應相關信號分子，如外界誘導信號或體內代謝物水平，以動態調節代謝通路中基因的表達水平［225］，如大腸桿菌中被深入研究的多種誘導型啟動子系統，包括乳糖操縱子、色氨酸操縱子以及來源于λ噬菌體的T7轉錄系統和PLPR-Clts857 溫敏啟動子系統等［226］。這類系統在發酵工業中得到很好的應用，例如內蒙古農業大學職業技術學院曹志軍課題組［227］將PLPR-Clts857 溫敏型啟動子系統用于兩步法發酵生產丙酮酸，發酵前期在40 ℃下使溫敏開關啟動noxE基因的表達，以消耗NADH 促進生物量和丙酮酸的積累，而后在34 ℃關閉開關抑制細胞生長，提高了丙酮酸的產量，最終使丙酮酸的產量達到了93.0 g/L。

除了高溫誘導調控外，近期清華大學陳國強課題組和中國科學院微生物所婁春波團隊合作開發了冷誘導型開關系統，該系統使用一種熱失活的蛋白酶和一種冷失活的TEV 敏感轉錄因子在轉錄和翻譯后兩個水平調控基因的表達，且為了提高系統的嚴謹性，研究者還向系統引入了一個額外的蛋白水解模塊，以專門降解殘留蛋白或由于泄漏表達的蛋白，該工作建立了一個高性能的冷誘導系統，用于嚴格和快速控制基因表達，使表達熱不穩定重組蛋白成為可能，同時該系統在基礎研究、工業和生物醫學應用方面也具有巨大的潛力［160］。基于CRISPR-Cas 的可誘導控制的基因編輯、激活與干擾系統也被實現［211，228-229］，如通過使用誘導型啟動子控制dCas9的表達或光誘導控制gRNA 的活性［230］，為動態控制基因實現時空調控提供了又一強有力的工具。最近，研究人員利用光敏核苷酸替換了部分gRNA序列，通過光來實現對DNA 序列的切割，從而實現基因編輯在時間和空間上的調控，該技術被稱為cfCRISPR，為靶標DNA精準切割的時空調控提供了參考［231］。

除了人工誘導動態調控系統外，細胞自主誘導調控系統也被逐漸開發應用。日本金澤大學Tsuge 課題組［232］在谷氨酸棒桿菌中開發了一個利用厭氧特異性啟動子調節碳代謝流的系統，使用乳酸脫氫酶基因（ldhA）的厭氧特異性啟動子替換葡萄糖-6-磷酸異構酶基因（pgi）的啟動子，實現了在有氧條件下碳流重定向到PPP 途徑生成大量NADPH 供1，5-戊二胺（1，5-diaminopentane）生產使用的氧響應開關，使1，5-戊二胺的產量、收率、生產速率分別提高了4.6 倍、4.4 倍和2.6 倍，在有氧生長后pgi會自動在厭氧條件下被誘導，使碳流轉向糖酵解途徑，繼續生產琥珀酸，這一方法使通過單一菌株兩步發酵分階段生產不同化合物成為可能，降低了生產成本。中山大學劉建忠課題組［233］在大腸桿菌中使用群體感應（quorum sensing，QS）系統動態調控4-羥基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，4HPAA）代謝途徑，使4HPAA產量達到17.39 g/L±0.26 g/L。

在運動發酵單胞菌中關于靜態調控相關的研究和使用相對較多，如常用的強啟動子Pgap、Ppdc、Peno和PadhB等，通常用于過表達目的基因，以調控目標產物的產量或提高對抑制物的耐受性［5，60］。Contreras 教授與作者課題組合作在解析sRNA 和5'UTR 的調控方面開展了相關研究［110，117，190，192］，并于最近提出了sRNA-sRNA 及sRNA-protein 之間相互作用的調控網絡［117］。關于運動發酵單胞菌動態調控方面的研究目前尚少，成功應用的有四環素誘導型啟動子Ptet，該誘導型啟動子首次在運動發酵單胞菌中應用于調控2，3-丁二醇的生產［76］，隨后也被用于雙熒光報告基因的構建［21］和異丁醇生產途徑的調控［63］。最近，Landick課題組［234］報道了使用lacIq基因和PT7A1-O34啟動子在運動發酵單胞菌中實現了對發酵代謝途徑中的關鍵酶丙酮酸脫羧酶（Pdc）基因的誘導控制，達到了對運動發酵單胞菌碳流控制的目的。

在運動發酵單胞菌中建立精準的代謝調控，將有利于更好地在時間和空間上調控相關代謝途徑，發揮其所擁有的優勢性能。基于組學數據篩選與雙熒光報告基因系統鑒定的策略［21］，篩選鑒定了運動發酵單胞菌中內源乙醇誘導型啟動子，但對其具體誘導機制及應用還需進一步研究［159］。在其他菌株中開展的相關研究及進展，為填補運動發胞單胞菌在這一領域的不足提供了研究思路，是未來值得投入的研究方向。

總之，運動發酵單胞菌具有安全、環境適應性強、糖及乙醇耐受性高、可在厭氧條件下通過ED 途徑進行乙醇發酵、糖代謝速率快及乙醇收率高等優點，已經在生物能源、平臺化合物、食品和藥品等不同工業領域取得了一系列成果。同時，運動發酵單胞菌基因組小，具有一系列包括內、外源CRISPR-Cas 基因編輯系統在內的遺傳工具及系統與合成生物學研究方法，積累了大量的生理、生化及系統生物學數據，有望發展為一個高效的工業底盤細胞，尤其是基于丙酮酸為前體物質生產多種平臺化合物的高效細胞工廠。但是，我們仍需在目前研究較少的基因時空表達網絡與動態調控機制等基礎理論研究以及高通量基因編輯與自動化篩選技術等方面取得更大突破；進一步理解制約遺傳轉化效率的分子機制，建立提高轉化效率的方法策略；揭示影響基因組編輯效率的因素，建立可循環開展對基因組多位點同時編輯的高效CRISPR-Cas 基因編輯體系及單堿基編輯方法；結合生物信息學及機器學習等方法從多組學數據中挖掘生物元件，優化包括雙報告基因系統在內的生物元件定量檢測體系，豐富生物催化與調控元件庫；建立生物元件、邏輯線路、代謝途徑高通量組裝與性能檢測方法；整合運動發酵單胞菌生理、生化及多組學數據，建立數字細胞模型，指導包含防泄漏生物安全體系在內的安全、高效細胞工廠的理性設計及應用。