寧麥9號/揚麥158重組自交系群體產量性狀的遺傳解析

姜 朋 張 旭 吳 磊 何 漪 張平平 馬鴻翔,*孔令讓

1 江蘇省農業生物學重點實驗室 / 江蘇省農業科學院, 江蘇南京210014; 2 作物生物學國家重點實驗室 / 山東農業大學, 山東泰安271018; 3 江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心 / 揚州大學, 江蘇揚州 225009

高產是小麥育種的重要目標, 小麥產量由單位面積穗數、每穗粒數及粒重構成, 三者的平衡協調發展決定著產量的最終實現[1]。小麥單位面積穗數取決于基本苗、分蘗數和分蘗成穗率, 是獲得高產的基礎, 分蘗數與最終成穗數是小麥群體對外界環境適應的結果。穗粒數與穗數往往呈顯著負相關關系, 即增加穗粒數會降低單位面積穗數。千粒重則相對獨立, 多數研究表明其對產量的直接貢獻最大,在群體條件下增加單穗粒重是增加群體產量潛力的關鍵[2]。千粒重主要受加性效應的控制, 在產量因素中遺傳力最高, 可達59%～80%[3]。小麥產量及構成要素為數量性狀, 呈現連續變異, 受微效多基因調控[4]。

分子生物學的發展為復雜性狀分子定位和標記輔助育種提供了有力工具, 小麥產量及構成要素性狀的遺傳定位研究已有諸多報道, Mason等[5]對不同播期下的小麥產量性狀進行調查, 在 3B、5B、7D染色體上檢測到3個穗數QTL, 在2D和5A染色體上檢測到2個千粒重QTL。Hu等[6]以包含4個RIL群體的巢式作圖群體為材料, 在 8個環境中進行了產量性狀調查, 鑒定到 8個多環境穩定的位點, 并利用自然群體進行了驗證。Tura等[7]在32個環境中對一個 DH群體開展了產量性狀評價, 分別鑒定到24個和27個產量、千粒重QTL, 并對其中2個主效位點QYld.aww-1B.2與QTgw.aww-1B進行了精細定位。由于產量及其構成因素的復雜性, 產量性狀的定位結果存在較大差異。

隨著基因組學的發展, 分子標記從 RFLP、RAPD和SSR等發展到近年來的SNP標記。SNP具有遺傳穩定、數量多、分布廣等特點, 并且適于高通量檢測, 基于其開發的 9k、90k、660k等基因型芯片集合了成千上萬個SNP標記, 大大提高了遺傳圖譜的質量和密度[8-10]。基于 SNP位點差異, 還可開發特異匹配引物末端堿基的 KASP (Kompetitive Allele Specific PCR)標記, 可對 SNP位點進行精準的雙等位基因判斷, 并具有高通量的特點, 適于大量樣本的分子標記檢測, 與育種選擇相契合, 在育種中具有廣泛應用前景[11]。

寧麥9號與揚麥158分別是江蘇省農業科學院與江蘇省里下河地區農業科學研究所育成的高產優質抗病小麥品種, 不僅曾在生產上具有較大的推廣面積, 而且是重要的育種親本, 近 10年長江中下游冬麥區國家區試與江蘇省淮南區試各有 36個和 34個品種通過審定, 含有寧麥 9號或揚麥 158的遺傳背景的材料均為 27個, 占比近 80%。在產量性狀方面, 寧麥9號多穗、多粒, 但千粒重偏低,揚麥158穗粒數不及寧麥9號, 但千粒重較高, 二者在產量構成因素方面存在差異[12-13]。本研究對來源于寧麥9號與揚麥158的重組自交系群體進行多環境的產量性狀評價, 并結合高密度遺傳圖譜, 試圖解析其產量性狀的遺傳的分子機制, 為長江中下游麥區產量性狀的分子標記輔助選擇育種提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與數據采集

以寧麥 9號×揚麥 158構建重組自交系(RIL)群體(F2:8), 包括 282個家系。2015—2016、2016—2017和2017—2018連續3個生長季將RIL群體及其親本種植于江蘇省農業科學院六合基地, 為方便描述,以收獲年份2016、2017與2018分別表示3個環境。采用增廣設計[14], 2個親本及隨機選取的30個材料種植2次重復, 其余材料1次重復, 3行小區種植, 每行60粒, 行長1.6 m, 行距0.25 m, 常規栽培管理。

灌漿后期調查每個小區中間行穗數, 并換算為公頃穗數; 收獲時先取10個長勢均勻的麥穗進行混合脫粒, 并統計總粒數, 進一步換算為單穗粒數;將整小區進行收獲測產, 并換算為公頃產量; 最后利用萬深籽粒考種機(SC-A1, 浙江杭州)進行千粒重測定。另同時測量139份小麥高代品系材料的千粒重, 用于后續驗證。

1.2 數據處理與QTL分析

表型初步統計采用Microsoft Excel 2016, 相關分析、方差分析及t檢測采用SPSS 19.0。遺傳力計算依據 He等[15]的方法, 計算公式為h2=δg2/(δg2+δg*y2/y+δe2/ry)。其中δg2表示基因型方差,δg*y2表示基因型與環境互作方差,δe2為誤差,y代表環境數目,r代表重復數。

采用Illumina 90K芯片獲取基因型。遺傳圖譜覆蓋21條染色體, 包含41個連鎖群, 2285個bin標記, 總長為3022 cM[16]。采用IciMapping 4.1軟件的完備區間作圖法(inclusive composite interval mapping, ICIM)進行QTL定位[17], walking step設為0.1 cM, LOD閾值設為2.5。

1.3 KASP標記的開發

根據SNP位點和側翼序列設計PCR擴增引物,開發KASP分子標記。每個標記設計2條SNP特異性引物(F1/F2)和一條通用引物(R), F1尾部添加能夠與FAM熒光結合的特異性序列5′-GAAGGTGACCA AGTTCATGCT-3′, F2尾部添加能夠與HEX熒光結合的特異性序列 5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT T-3′。利用 Polymarker (http://www.polymarker.info/)進行 KASP引物設計, 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

從RILs群體中隨機挑選46份材料進行幼嫩葉片取樣, 采用 CTAB法[18]提取基因組 DNA。KASP反應總體系為 5 μL, 包含 2×KASP Master Mix 2.5 μL、KASP Assay Mix (引物混合工作液) 0.07 μL、濃度為 20 ng μL-1的模板 DNA 2.43 μL。KASP 反應程序為, 第一步: 94℃, 15 min; 第二步: 94℃, 20 s,61～55℃, 1 min, 每個循環降低0.6℃, 共進行10個循環; 第三步: 94℃, 20 s, 55℃, 1 min, 共進行26個循環, PCR在購買自LGC公司型號為Hydrocycler16的水浴PCR儀中進行。通過KASP熒光分析儀(LGC公司型號為PHERAstar plus)掃描分析PCR結果。

2 結果與分析

2.1 產量及其三要素的表型分析

在連續3年的試驗中(表1), 寧麥9號穗粒數均高于揚麥 158, 而千粒重低于揚麥 158, 而穗數與產量在不同環境中表現不一致, 同時穗數與產量的變異系數明顯高于穗粒數與千粒重。從遺傳力來看,產量僅為 0.18, 穗數為 0.13, 說明此兩性狀受環境影響較大, 方差分析結果同樣證實了這一點(表2),穗數與產量在不同環境中均呈極顯著正相關(表3)。穗粒數與千粒重呈負相關, 基因型與環境對穗粒數和千粒重有極顯著影響, 穗粒數的遺傳力為 0.37,不同環境間相關性不穩定, 與產量的相關性也不穩定; 千粒重的遺傳力為 0.60, 不同環境間均表現一致, 與產量呈極顯著正相關。此外, 方差分析表明,基因型與年份的互作對這4個性狀均無顯著影響。

2.2 產量及其三要素的QTL分析

綜合 3年表型數據, 檢測到 9個控制穗數的QTL, 分布在1A、1B、2B、4B、5A、7A共6條染色體上, 表型變異解釋率為3.45%～10.39% (表4和圖1); 檢測到8個控制穗粒數的QTL, 分布在2B、3B、4A、5B、6B、7A共 6條染色體上, 表型變異解釋率為3.76%～8.66%; 檢測到10個控制千粒重的QTL, 分布在1A、1B、2B、3A、4A、4B、5A、5B、7A、7B共 10條染色體上, 表型變異解釋率為3.10%～9.43%; 檢測到 12個控制產量的 QTL, 分布在1B、2A、4B、5A、5B、6A、6B、7A、7B共10條染色體上, 表型變異解釋率為3.23%～11.79%。

表1 產量及其三要素的表型統計Table 1 Phenotypic analysis for yield and its components

表2 產量及其三要素的方差分析(F值)Table 2 ANOVA of yield and its components by F-value

表3 產量及其三要素的相關分析Table 3 Correlation analysis of yield and its components

在上述 QTL定位結果中, 控制千粒重的QTL-Qtkw-1B、Qtkw-4A及Qtkw-7A等3個QTL能夠被重復檢測到。根據連鎖圖譜位置分析, 4A染色體上的穗粒數QTLQkn-4A與千粒重QTLQtkw-4A,5A染色體上穗數QTLQsn-5A、千粒重QTLQtkw-5A與產量QTLQyd-5A, 6B上穗粒數QTLQkn-6B與產量 QTLQyd-6B定位區間重合或相近。進一步分析其加性效應, 4A染色體上的高穗粒數QTL和高千粒重QTL分別來自寧麥9號與揚麥158, 5A染色體上的高穗數、穗粒數和產量QTL均來源于寧麥9號, 6B染色體上的高穗粒數和產量QTL分別來自寧麥9號與揚麥158。

2.3 千粒重的QTL聚合效應分析

在產量及其構成要素中, 千粒重的遺傳力最高。寧麥9號/揚麥158的282個重組自交系群體中在3年中被重復檢測到的千粒重QTL有3個, 分別位于1B、4A和7A染色體上(表4), 從不同QTL對千粒重的影響看, 后代中存在Qtkw-1B、Qtkw-4A及Qtkw-7A單一位點時,Qtkw-4A對千粒重的影響最顯著也最穩定(表5), 從增加千粒重的效應看,Qtkw-4A亦優于Qtkw-1B及Qtkw-7A, 不同等位變異最高可產生2.07 g的千粒重差異。當后代中聚合2個位點后, 2個位點的組合效應優于單個位點,Qtkw-1B+Qtkw-4A的組合最穩定, 且高于其他兩種組合, 在不同年份可使千粒重提高 2.76～3.44 g, 而Qtkw-1B+Qtkw-7A、Qtkw-4A+Qtkw-7A兩種組合無顯著差異。后代中聚合 3個位點后, 對千粒重的效應顯著提高,2017年甚至產生超過5 g的千粒重差異。

?

?

?

2.4 千粒重QTL的KASP標記開發與利用

為了更好地對3個千粒重QTL位點進行育種利用, 基于其區間標記序列開發了適于高通量分型的KASP標記。首先從 3個標記區間各選擇 2～3個同源性較低的SNP標記進行引物設計(附表1), 經過擴增驗證, Kukri_c42354_263、IAAV5722與IACX1477擴增效果良好(附圖1), 可應用于Qtkw-1B、Qtkw-4A與Qtkw-7A等3個位點的育種選擇。

進一步利用開發成功的 3個KASP標記對139份小麥高代品系材料進行基因分型, 并結合表型數據進行統計分析(表6), 發現3個標記在千粒重選擇中均具有顯著作用, 2個標記的選擇效果優于單標記選擇,而聚合3個標記后, 產生了超過6 g的千粒重組間差異,與遺傳效應分析結果(2.3)基本一致。Qtkw-4A與Qtkw-7A兩個位點多呈現來源于揚麥158的優勢等位變異, 而Qtkw-1B未表現出明顯的選擇傾向。

表5 千粒重QTL不同等位變異的t檢測Table 5 t-test of different alleles of the QTL for 1000-kernel weight

表6 千粒重KASP標記的效用檢測Table 6 Detection of the KASP marker for 1000-kernel weight

3 討論

未來全球對小麥的需求仍將呈增長趨勢, 進一步提高單產潛力仍然是小麥育種最基本和最重要的目標[35]。分子標記輔助選擇用于小麥育種的研究已有20多年的歷史, 但在育種中應用較好的是抗病和品質性狀相關標記, 產量相關性狀的分子標記研究仍有待加強[36-37]。本研究以長江中下游品種的骨干親本寧麥9號和揚麥158雜交構建的重組自交系群體為材料, 連續 3年對單位面積產量、單位面積穗數、穗粒數和千粒重進行QTL定位分析, 共定位到39個QTL, 研究結果驗證了產量及其構成因素遺傳的復雜性, 性狀受微效多位點控制。

與前人研究比較(表4), 控制千粒重的Qtkw-2B與Qtkw-4B, 控制產量的Qyd-5B.1與前人定位的QTL一致[24,27];Qsn-1A、Qsn-1B.1與Qsn-1B.2等此前報道與產量性狀相關, 但并未明確與穗數有關[19-22];同樣, 類似的 QTL還有控制穗粒數的Qkn-3B.2與Qkn-5B.1[5,25], 控制千粒重的Qtkw-5B與Qtkw-7B[20,28]和控制產量的Qyd-5A.1與Qyd-5A.2[23]。本研究檢測到了一些的新的 QTL, 分別是控制穗數的Qsn-2B、Qsn-4B與Qsn-7A.1, 控制穗粒數的Qkn-2B、Qkn-3B.1與Qkn-6B, 控制千粒重的Qtkw-3A與Qtkw-7A, 控制產量的Qyd-1B.2、Qyd-5B.2與Qyd-6B,這些位點此前均未曾報道與產量性狀有關。通過QTL在遺傳圖譜中的定位分析與比對, 發現 3個QTL簇, 分別位于4A、5A及6B染色體上, 4A和5A染色體區段與產量及其構成要素均相關, 6B染色體區段與穗粒數、產量相關, 且此前未被報道。4A區段調控穗粒數與千粒重的加性效應分別來源于寧麥9號與揚麥158, 與兩個親本對應的多粒、大粒特征一致, 在選擇時可根據育種目標合理選擇親本;5A區段的加性效應均來源于寧麥9號, 在產量育種中可選擇寧麥9號的優良等位變異; 6B區段控制高產的加性效應來源于揚麥158, 可選擇揚麥158的優良等位變異在高產育種中應用。

在產量構成因素中, 不同地區、不同時期及不同高產品種的產量結構類型差異很大, 程順和等[38]提出應將穗數維持在一定水平上, 主攻粒重。宋健民等[39]分析了近年來山東省通過審定的55個小麥品種產量性狀的變化趨勢, 結果顯示產量呈顯著上升趨勢, 穗數與穗粒數變化不顯著, 千粒重顯著增加; 沈磊和趙凱銘[40]根據河南省2001—2014年間審定的202個品種的統計數據, 發現穗數與穗粒數較為穩定, 千粒重呈上升趨勢; 蔣進等[41]對四川省2008—2018年育成的 100個品種進行分析, 發現產量水平逐年升高, 穗數、千粒重呈下降趨勢, 穗粒數呈上升趨勢, 而其中高產品種穗數與千粒重均處于較高的水平; 姚國才等[42]以長江中下游麥區育成的和大面積應用的小麥品種為材料進行分析, 在產量水平由低中產到較高產時, 穗數增加較多, 千粒重次之, 穗粒數變化較小, 而在高產組次中, 穗數基本穩定, 每穗粒數增幅較大, 千粒重明顯提高。上述研究表明, 千粒重是當前高產育種的重點改良因素。在產量三要素的遺傳中, 穗數的遺傳力最低, 國外研究報道中有的低至0.070和0.046[38], 多項研究結果表明穗數的遺傳力在 0.2以下[43-44], 本研究結果與其相近; 前人研究還表明, 穗數與產量的相關性較高[45-46], 但易受環境條件影響, 因而產量的遺傳力也不高, 本研究檢測到的穗數和產量QTL盡管在同一環境中可同時定位到, 但受環境影響不穩定,因此在不同環境中未能重復檢測到。與前人研究類似, 本研究表明基因型與年份分別影響著產量及其三要素性狀, 基因型與年份(環境)的互作對產量性狀的影響在不同研究中有不同結果[49-51], 本研究中基因型與年份互作對產量及其三要素的影響不顯著,說明產量及其三要素不是隨著年份的變化而呈線性變化, 反映了產量及其三要素受基因型及環境影響的復雜性。

在產量構成因素中, 千粒重具有較高的遺傳力,在本研究中為0.60, 與前人報道相近[47-48], 因此, 可通過分子標記輔助選擇對千粒重性狀進行改良。研究檢測到 3個穩定的千粒重 QTL, 遺傳效應分析顯示其對千粒重均有顯著影響。與前人研究比較發現,Qtkw-1B附近包含穗長、穗粒數的控制位點[21],Qtkw-4A附近區域存在著穗數和穗粒數的控制位點[23-24],Qtkw-7A是一個新鑒定到的千粒重QTL。

近些年來, 分子標記輔助選擇在小麥育種中的應用越來越廣泛, 特別是適于高通量分型的 KASP標記, 其與大規模育種篩選策略完美契合, 在育種中具有良好的應用前景。本研究成功開發了 3個千粒重QTL相連鎖的KASP標記, 并在育種材料中進行了初步應用, 選擇效果較好, 3個QTL用于標記輔助選擇對提高千粒重有明顯效果, 且多位點聚合的選擇效果優于單一QTL的選擇; 但多位點選擇在提高選擇效果的同時, 增加了工作量, 減少了中選材料, 需結合實際育種規模選擇相應的育種策略。

4 結論

結合 3個環境的產量數據, 鑒定到控制穗數、穗粒數、千粒重及產量的QTL分別為9、8、10與12個, 其中穗數、穗粒數和產量的遺傳力較低, 千粒重的遺傳力較高, 可進行遺傳選擇。針對 3個穩定的千粒重 QTL, 進一步成功開發出相連鎖的KASP標記, 并在育種材料中進行了初步應用, 3個QTL對提高千粒重有明顯效果, 且多位點聚合的選擇效果優于單一QTL的選擇。本研究結果可應用于小麥千粒重的遺傳改良。

附表1 千粒重的KASP標記序列Table S1 Sequence of KASP markers for 1000-kernel weight