小麥矮稈突變體的鑒定及其突變性狀的關聯分析

賀軍與 尹順瓊 陳云瓊 熊靜蕾 王衛斌 周鴻斌 陳 梅 王夢玥 陳升位

云南農業大學農學與生物技術學院, 云南昆明 650201

自“綠色革命”以來, 全球種植的小麥品種中有 90%含有矮稈和半矮稈基因[1-5]。迄今為止, 已報道的矮稈和半矮稈基因超過 25個, 但可用于小麥育種的矮稈基因局限于Rht-B1b、Rht-D1b、Rht8和Rht9[6-7]。矮稈基因Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8在降低小麥株高時對其他性狀無顯著不良影響, 且Rht-D1b、Rht8和Rht9可顯著增加穗粒數[8-12]。李杏普等[13]發現Rht10和Rht12的降稈作用大于Rht8, 但其株系的地上部分生物量低于Rht8株系。王清海等[14]研究發現Rht14、Rht16和Rht18的降稈效應分別為47.3%、39.9%和36.0%。攜帶Rht14、Rht16和Rht18的矮稈株系的小穗小花數變化不大, 但穗長變長。Rht5在降低小麥株高的同時會減少每穗小穗數和穗粒數[15]。前人研究表明, 大多數小麥推廣品種攜帶的矮稈基因為Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8[3-6,16-17], 可有效利用的矮稈親本不足, 育成品種遺傳背景狹窄。創制新突變體是解決該問題的有效策略。本文采用甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate, EMS)誘變‘云麥 53’ (國審品種)成熟種子, 通過誘變植株的連續3年套袋自交成功獲得了一批株高、小穗密度和小花數等性狀不同的候選突變體?；谶B續2年的田間觀察和常見矮稈基因的12個特異性分子標記檢測鑒定了26株矮稈突變株, 分析了26個突變體的株高差異及其與穗長、小穗數和小穗密度等農藝性狀的遺傳關聯性,評估了矮稈突變體的育種價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

誘變親本‘云麥 53’由云南省農業科學研究院糧食作物研究所提供, 突變體由課題組創制。所有材料由課題組繁育并保存。

1.2 試驗材料的種植及取樣

1.2.1 材料誘變和繁育 將 15,000?！汽?53’種子置于三角瓶中, 用pH 8.0的0.05 mol L-1磷酸緩沖液(PBS)震蕩浸泡4 h, 再用0.6% EMS室溫震蕩浸泡16 h, 然后用自來水沖洗4 h。誘變種子及其后代均播種于云南農業大學昆明市盤龍區試驗教學農場。分別套袋自交M1、M2和M3候選突變材料, 按單株收獲種子。

1.2.2 農藝性狀調查 按隨機排列種植試驗材料, 每個材料種植1行, 5行后種植1行誘變親本。行距20cm, 株距5 cm, 3次重復。其他田間管理措施與常規大田管理一致。于2018—2019年度和2019—2020年度分別在開花期調查穗長、小穗數和小花數, 待種子成熟后調查株高、平均節間長和節間數。M2代調查單株性狀, M3株系隨機調查5株, 以5株均值代表株系性狀的表型值。按下列公式計算小穗密度、平均節間長。

小穗密度=單株小穗數/單株穗長

平均節間長=單株節間長/單株節間數

1.2.3 矮稈基因的分子標記檢測 于拔節期剪取M2單株及其誘變親本的幼嫩葉片, 置于-80℃保存備用。采用CTAB法提取基因組 DNA。采用 Ellis等[18-19]報道的BF-WR1、BF-MR1、BF-WR2、BF-MR2、WMC317、BARC102、BARC151、WMC410和 WMS577, 以及XBARC3[20]、Xgwm261[20]和 WMC503[21]特異性標記檢測突變體攜帶的矮稈基因(表1), 其中BF-WR1和BF2-WR2為野生型(株高正常)基因標記, 其余標記為突變型(矮稈)基因標記。由上海生工生物技術有限公司合成所有引物。參照前人報道的PCR擴增條件擴增各標記, 采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 PCR擴增產物。上述標記均重復檢測3次, 3次檢測結果一致。

1.2.4 農藝性狀的關聯分析 基于SPSS 25.0軟件的t測驗、聚類、方差、多重比較和相關分析模塊默認參數, 分析突變體株高差異及其與穗長、小穗數和小穗密度等性狀的遺傳關聯性。顯著和極顯著水平分別為5%和1%。

表1 矮稈基因及其特異性標記的引物序列和片段長度Table 1 Specific molecular markers of dwarf genes and the fragment length and primers sequence of the markers

2 結果與分析

2.1 候選矮稈突變體的農藝性狀差異分析

本研究采用t測驗檢測了‘云麥53’與33個候選材料的株高(M2單株表型值, M3株系均值)差異(表2)。結果表明,mutant 2、mutant 4、mutant 5等 26個材料與‘云麥 53’的株高存在顯著或極顯著差異, 為矮稈突變體。在26個矮稈突變體中mutant 16、mutant 23、mutant 25和mutant 26的株高值低于20 cm, mutant 18、mutant 19和mutant 20的株高值大于40 cm, 其余19個突變體的株高值介于20～40 cm之間(圖1)。與‘云麥 53’相比, mutant 4、mutant 5 和 mutant 7等18個突變體的穗長顯著或極顯著縮短; mutant 4、mutant 5和 mutant 7等 11個突變體的小穗密度顯著或極顯著增加;mutant 18的小花數顯著減少; mutant 5、mutant 11、mutant 14等13個突變體的平均節間長顯著或極顯著縮短; mutant 5、mutant 10和mutant 14等6個突變體的節間數顯著或極顯著減少(表2 和圖2)。mutant 7、mutant 12、mutant 24、mutant 28和mutant 29的節間數在M2和M3代中未發生分離, 均低于‘云麥53’的節間數, 但因方差為0、未做t測驗。26個矮稈突變體攜帶株高、穗長和小穗密度等多個突變性狀。

2.2 候選矮稈突變體的分子標記檢測

為了進一步驗證 26個矮稈材料, 本文采用前人報道的矮稈基因的12個特異性標記檢測了33個候選材料及其誘變親本。結果表明, 在‘云麥53’中未檢測到BF-MR1 (Rht-B1b)、BF2-WR2 (Rht-D1a)、BARC102 (Rht5)和 WMS577 (Rht13)標記, 但檢測到其他9個標記。與‘云麥53’相比, mutant 1等32個候選突變體的BARC151 (Rht9)標記, mutant 2等5個候選突變體的Xgwm261 (Rht8)、WMC503 (Rht8)標記均具有差異, 表明其Rht9和Rht8基因發生了突變。在33個候選突變體中, mutant 3與‘云麥53’的共有擴增標記較多(7個), mutant 11與‘云麥 53’僅有 2個共同擴增標記(表3和圖3),mutant 1、mutant 2、mutant 3、mutant 27 和 mutant 28 的Xgwm261 (Rht8)、WMC503 (Rht8)和 BARC151 (Rht9)均發生變異, 其中BARC151 (Rht9)標記位點的突變頻率最高(表3)。

表3 ‘云麥53’和候選突變體中檢測到的矮稈基因Table 3 Dwarf genes detected in the genome of ‘Yunmai 53’ and candidate mutants

2.3 基于7個性狀的矮稈突變體聚類分析

基于株高、穗長和小穗密度等7個性狀的聚類分析結果表明, 所有材料可聚為2個大類, 第1大類包括誘變親本,第2大類包括所有突變體(圖4)。第2大類可分為5個亞類,其中mutant 18和mutant 16分別聚為第1、2亞類, mutant 5、mutant 10和mutant 23等5個突變體為第3亞類, mutant 2、mutant 4和 mutant 6等 7個突變體為第 4亞類, 其余 12個突變體為第5亞類(圖4)。與‘云麥 53’相比, 5個亞類的突變體均表現植株矮化、穗長和平均節間長縮短,但其余4個性狀出現了分化。其中第1亞類突變體的小穗數和小花數極顯著減少, 但小穗密度和節間數沒有差異;第2～4亞類突變體的小穗密度極顯著增加, 小花數和節間數極顯著減少, 但小穗數沒有明顯變化(圖5)。在 5個亞類中, 第 1亞類突變體的小穗數和小花數降幅最大; 第 2亞類的株高、穗長和平均節間長的降幅和小穗密度的增幅最大, 第3亞類突變體的節間數降幅最大(圖5和附表1)。

2.4 突變農藝性狀間的相關分析

基于26個突變體及其誘變親本的株高等7個性狀的二元相關和偏相關分析表明, 株高與穗長、小穗密度和平均節間長等 4個性狀的二元相關系數達到了顯著或極顯著水平, 但只有平均節間長和節間數與株高偏相關; 穗長與小穗數、小穗密度和平均節間長的二元相關系數達到了顯著或極顯著水平, 但只有小穗密度和平均節間長與穗長存在負偏相關; 小穗數與小穗密度和小花數的二元相關和偏相關系數均達到了極顯著水平; 小穗密度與小花數和節間數的二元相關系數達到了顯著或極顯著水平,但偏相關系數不顯著; 雖然平均節間長與節間數的二元相關系數不顯著, 但偏相關系數達到了顯著水平(表4)。上述結果表明, 26個突變體的株高與平均節間長和節間數關聯遺傳, 其余4個性狀與植株矮化沒有遺傳關聯性。

3 討論

通過誘變親本和候選突變體連續 2個年度的株高比對分析, 作者發現了 26個矮稈突變體。基于前人報道的矮稈基因的12個特異性標記檢測結果表明26個矮化材料至少攜帶有2個矮稈基因標記位點。雖然mutant 1、mutant 3和mutant 13等7個候選突變體中也檢測到了矮稈基因突變, 但植株偏高, 為(33.76±10.16)～(63.99 ±2.51) cm, 且與誘變親本‘云麥53’的株高沒有顯著差異。筆者認為這可能是2個年份間的株高波動降低了“t”值所致。在33個候選突變體中, 26個材料明顯矮化、且攜帶不同的矮稈突變基因, 因此可判定為矮稈突變體。

除株高外, 26個矮稈突變體還攜帶穗長縮短、小花密度增加和節間數減少等不同突變性狀。通過分子檢測本研究發現26個突變體均攜帶與‘云麥53’不同的矮稈基因組合, 如mutant 11攜帶Rht5和Rht 12矮稈基因(可能還攜帶其他未被檢測的矮稈基因), mutant 2攜帶Rht-D1b、Rht4、Rht5等9個矮稈基因。通過推廣品種株高與穗長、小穗數和穗粒數的關聯分析, 陳亮等[8-12]發現矮稈突變基因Rht-D1b、Rht8和Rht9可增加穗粒數; 王清海等[13-14]研究發現Rht8、Rht10、Rht12、Rht14、Rht16、Rht18等矮稈基因的效應不同,Rht10和Rht12的降稈效應大于Rht8的[3,5]; Baloch等[16]發現Rht14、Rht16和Rht18可增加穗長,Rht5可減少每穗小穗數。前人研究結果表明小麥矮稈基因對穗長、小穗數和穗粒數等性狀可能具有多效性,但在不同遺傳背景中矮稈基因的遺傳效應不同。因此作者認為是矮稈基因與穗長、小穗密度和小花數等性狀的突變基因及其組合不同導致了26個突變體的農藝性狀差異。

表4 不同突變性狀的二元相關和偏相關系數及其顯著性Table 4 Binary correlation, partial correlation coefficients and significances among the different mutant traits

本研究發現株高與平均節間長和節間數、以及穗長與小穗數、小穗數與小穗密度、小穗與小花數等性狀關聯遺傳, 該結果與前人報道的基本一致[22-32]。雖然株高降低后mutant 7等 3個突變體的小穗數和小花數增多(均未達到顯著水平), 其余突變體的穗長縮短、小穗數和小花數減少、小穗密度增加, 但株高與穗長等4個性狀的偏相關系數均未達到顯著水平。作者認為該結果可能與本文研究所用材料大多為相同親本誘導的矮稈突變體有關, 可能是矮稈基因及其組合的多效性較低或者矮稈與其他性狀的突變基因位點的連鎖強度較低導致了株高與穗長、小穗數和小穗密度等性狀不能關聯遺傳。通過進一步自交繁育,可望從26份矮稈突變體中篩選到適合不同育種需求的矮稈親本。

通過聚類分析, 作者發現 26個矮稈突變體可分為農藝特性不同的5個亞類, 不同亞類間株高、穗長和小穗數等農藝性狀存在差異, 其中第2亞類和第3亞類的mutant 5、mutant 23和mutant 25等5個突變體株高不到20 cm, 均低于陸燕等的報道[12,17,33-35]。雖然株高較低, 但mutant 11、mutant 27和mutant 28等突變體的穗長、小穗數和小花數沒有變化, 且節間數只是導致部分突變體矮化的因素之一, 因此上述材料可用于小麥矮化育種。除此之外, 26個突變體攜帶的株高、穗長和小穗密度等突變性狀基因及其組合類型不同, 如mutant 16攜帶株高較低(13.61 cm±0.11 cm),穗長(3.72 cm±0.02 cm)和平均節間長(4.88 cm±0.62 cm)較短, 小穗密度(5.37±0.24)較高的基因組合; mutant 18具有植株偏高(44.08 cm±1.73 cm), 穗長偏長(7.08 cm±0.48 cm)小花數較少(33.25±0.25)的基因組合。基于上述突變體, 可望解析小麥株高及其構成因素、小穗密度和小花數等性狀的遺傳機制。

附表1 ‘云麥53’類群和5個矮稈突變體亞類的方差分析結果Table S1 ANOVA result of ‘Yunmai 53’ and 5 subclasses dwarf mutants