2型糖尿病關(guān)鍵信使RNA和微小RNA的鑒定▲

李圣琦 楊 崢 吳林秀

(1 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，南寧市 530023，電子郵箱：22535821@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧市 530021)

隨著人們生活水平的提高，飲食豐盛和運(yùn)動(dòng)缺乏使得2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)已經(jīng)逐漸成為影響國(guó)民健康的主要因素，僅次于心腦血管疾病與惡性腫瘤[1-2]。有數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)T2DM的患病率約11%，60歲以上的老年人糖尿病患病率在20%以上[3]。糖尿病能夠引發(fā)一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，進(jìn)一步影響人們的生活質(zhì)量。目前雖有很多關(guān)于T2DM遺傳方面的發(fā)病機(jī)制的研究報(bào)道，但仍需進(jìn)一步探討。

近年來，隨著微陣列技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多研究者利用高通量的表達(dá)譜分析平臺(tái)檢測(cè)各種疾病中基因的表達(dá)差異，來分析疾病發(fā)展過程中遺傳變異的情況[4]。盡管在過去的幾十年，對(duì)T2DM的機(jī)制研究越來越清晰，并且已經(jīng)有相關(guān)研究利用表達(dá)譜技術(shù)分析相關(guān)基因在T2DM中的作用[5]，但是關(guān)于差異基因和微小RNA(microRNA,miRNA)通過何種分子途徑相互作用，卻鮮有研究報(bào)道。因此，我們利用生物信息學(xué)方法分析T2DM中差異表達(dá)的信使RNA(message RNA,mRNA)和miRNA之間的相互作用，特別是相互作用網(wǎng)絡(luò)中的路徑，以總結(jié)關(guān)鍵mRNA和miRNA在T2DM中的潛在作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 mRNA和miRNA基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)的收集 通過公開的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索與T2DM相關(guān)的研究，獲得兩個(gè)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集(GSE76895和GSE27645)進(jìn)行分析。每個(gè)數(shù)據(jù)集均含有T2DM組織樣品和正常組織樣品，其中GSE76895包含36例T2DM患者、32例正常人以及15例糖耐量受損患者的胰島組織芯片數(shù)據(jù)，GSE27645包含14例T2DM患者以及10例正常人外周血miRNA譜芯片數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)mRNA和差異表達(dá)miRNA的篩選 利用交互式在線分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析并篩選T2DM和正常組織樣品之間差異表達(dá)的mRNA和miRNA[6]。為了防止假陽性結(jié)果的發(fā)生，在GEO2R分析中。差異基因設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為校正后P值<0.05和|logFC|≥1。

1.3 差異表達(dá)mRNA的功能和途徑富集分析 利用在線工具DAVID[7](https://david.ncifcrf.gov/)和PANTHER[8](http://www.pantherdb.org/)分別對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)和通路富集分析。以P值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用STRING(http://string-db.org/)在線分析軟件，將差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行映射獲得蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)[9]，然后使用Cytoscape進(jìn)行可視化[10]。

1.5 miRNA靶標(biāo)的預(yù)測(cè)、mRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊分析 利用在線工具miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)預(yù)測(cè)來自GSE27645的差異表達(dá)miRNA的靶基因[11]。將差異表達(dá)miRNA的靶基因與差異表達(dá)mRNA進(jìn)行比對(duì)以獲得用于進(jìn)一步分析的交集，獲得miRNA-mRNA相關(guān)對(duì)列，采用Cytoscape繪制miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖。最后通過FunRich軟件[12]預(yù)測(cè)與差異表達(dá)miRNA相互作用的轉(zhuǎn)錄因子。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)mRNA和差異表達(dá)miRNA的篩選結(jié)果 數(shù)據(jù)集GSE76895中，與正常人相比，T2DM患者有40個(gè)差異表達(dá)mRNA，其中表達(dá)上調(diào)的mRNA共23個(gè)，表達(dá)下調(diào)的mRNA共17個(gè)，見圖1A及表1；其中與免疫相關(guān)的mRNA包括SCTR、TSHR、ARG2、FAM19A4、CALCA、SPP1，見表2。數(shù)據(jù)集GSE27645中，與正常人相比，T2DM患者有67個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中表達(dá)下調(diào)的miRNA共66個(gè)，表達(dá)上調(diào)的miRNA共1個(gè)，見圖1B及表1。

圖1 差異表達(dá)mRNA和miRNA火山圖

表1 數(shù)據(jù)集GSE76895與GSE27645的差異基因

表2 與免疫相關(guān)的差異表達(dá)mRNA

2.2 差異表達(dá)mRNA的功能和通路富集分析 GO富集分析表明，差異表達(dá)mRNA的蛋白產(chǎn)物在生物過程相關(guān)類別中與成人運(yùn)動(dòng)行為、pH調(diào)節(jié)相關(guān)，蛋白產(chǎn)物部分位于細(xì)胞膜、細(xì)胞外酶，分子功能主要涉及蛋白質(zhì)二聚活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，見表3。通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)mRNA共富集于12個(gè)通路，包括膽囊收縮素受體(cholecystokinin receptor,CCKR)信號(hào)通路、鈣黏著蛋白信號(hào)通路、果糖半乳糖代謝信號(hào)通路、γ-氨基丁酸合成信號(hào)通路、糖酵解信號(hào)通路、亨廷頓病相關(guān)信號(hào)通路、離子型谷氨酸受體途徑、Ⅰ組代謝型谷氨酸受體信號(hào)通路、Ⅲ組代謝型谷氨酸受體信號(hào)通路、毒蕈堿型乙酰膽堿受體1和3信號(hào)通路、Toll 受體信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路。

表3 差異表達(dá)mRNA的GO分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò) 利用已識(shí)別的差異表達(dá)mRNA繪制了43個(gè)節(jié)點(diǎn)(3個(gè)為新增預(yù)測(cè)的其他相關(guān)蛋白)和33個(gè)邊緣的PPI網(wǎng)絡(luò)，平均節(jié)點(diǎn)度為1.44，平均局部聚類系數(shù)為1.6e-05。利用MCODE插件篩選出K值較高的前3個(gè)節(jié)點(diǎn)作為網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵核心基因，分別為SCTR、TSHR、CALCA。 見圖 2。

圖2 差異表達(dá)基因蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因注：圖A為差異表達(dá)mRNA的PPI網(wǎng)絡(luò)； 圖B為PPI網(wǎng)絡(luò)中展示的核心基因，其中紅色為上調(diào)的基因，綠色為下調(diào)的基因。

2.4 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)以及與miRNA相互作用的潛在轉(zhuǎn)錄因子 針對(duì)GSE27645數(shù)據(jù)集獲得的差異表達(dá)miRNA，使用miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)共獲得19 414個(gè)靶基因。通過將差異表達(dá)miRNA的靶基因與差異表達(dá)mRNA進(jìn)行比較，取交集后得到37個(gè)miRNA-mRNA負(fù)相關(guān)對(duì)列，利用Cytoscape繪制miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖(圖3A)。其中，miRNA-16-5p是表達(dá)下調(diào)最明顯的miRNA之一，其靶向丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)；同時(shí)，PDK4可能被3種miRNA靶向調(diào)控，包括miRNA-103a-3p、miRNA-107、miRNA-15b-5p。通過FunRich軟件預(yù)測(cè)與差異表達(dá)miRNA相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SP1、早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子(early growth response 1,EGR1)是最顯著的潛在靶標(biāo)，見圖3B。

圖3 差異表達(dá)mRNA的通路分析結(jié)果

圖3 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖及miRNA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子注：圖A為miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖，其中圓圈表示mRNA，三角形表示miRNA，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)； 圖B為miRNA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。

3 討 論

T2DM是影響國(guó)民健康水平的主要疾病，盡管針對(duì)糖尿病的研究受到了廣泛的關(guān)注，但涉及驅(qū)動(dòng)T2DM發(fā)生和發(fā)展的重要基因和途徑有待進(jìn)一步研究，對(duì)T2DM的早期診斷和基因治療仍是目前亟待解決的問題。微陣列技術(shù)的成熟應(yīng)用使得確定疾病中的遺傳改變變得更加簡(jiǎn)便，從而可以用于相關(guān)疾病的靶標(biāo)基因篩選。因此，本文利用微陣列獲得的表達(dá)譜數(shù)據(jù)對(duì)T2DM發(fā)生的因素和機(jī)制進(jìn)行深入研究。

在本研究中，共篩選出40個(gè)差異表達(dá)的mRNA，包括23個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和17個(gè)表達(dá)下調(diào)基因；GO富集分析表明，這些差異表達(dá)mRNA的蛋白產(chǎn)物在生物過程相關(guān)類別中與成人運(yùn)動(dòng)行為、pH調(diào)節(jié)等相關(guān)，主要涉及的通路有CCKR信號(hào)通路、鈣黏著蛋白信號(hào)通路、果糖半乳糖代謝、γ-氨基丁酸合成、糖酵解等。其中與免疫相關(guān)的mRNA包括SCTR、TSHR、ARG2、FAM19A4、CALCA、SPP1。通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，我們鑒定出3個(gè)核心基因，包括表達(dá)下調(diào)的SCTR，以及表達(dá)上調(diào)的TSHR、CALCA。(1)SCTR是胰高血糖素受體家族的成員。SCTR蛋白定位在胰管和膽管內(nèi)的上皮細(xì)胞上，其與特異性促胰液素結(jié)合，參與不同的生物過程[13]。近期，有學(xué)者提出一種新觀點(diǎn)，即SCTR在飲食誘導(dǎo)的熱生成中也起著核心作用：充當(dāng)介導(dǎo)餐前熱生成的非交感性棕色脂肪活化劑，從而引起飽食感；飯后腸道釋放的促胰液素與棕色脂肪細(xì)胞中的SCTR結(jié)合，通過刺激脂解作用來激活棕色脂肪的生熱作用，這種作用在大腦中被感知并促進(jìn)飽食感[14]。由此推測(cè)，SCTR可能影響消化生物過程和脂肪分解代謝途徑，SCTR的下調(diào)導(dǎo)致飯后飽食感下降，在T2DM的發(fā)生中發(fā)揮作用。(2) TSHR 是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與甲狀腺功能減退、甲狀腺功能亢進(jìn)、家族性妊娠疾病等疾病相關(guān)。TSHR是由α和β兩個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)，它們的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶水平的增加。TSHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，與酪氨酸激酶受體之間存在交互作用，有研究表明TSHR與胰島素受體通路之間存在樞紐—胰島素受體底物1，且具有胰島素抵抗的患者表達(dá)異常磷酸化的胰島素受體底物1，這阻礙了胰島素受體依賴性信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。由此推測(cè)，TSHR的上調(diào)導(dǎo)致胰島素受體底物1異常磷酸化，導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生，從而在T2DM的發(fā)生中發(fā)揮作用。(3)CALCA是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與CALCA相關(guān)的疾病包括反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良和椎管狹窄。目前關(guān)于CALCA與T2DM的相關(guān)性研究較少。有研究表明，T2DM小鼠模型中CALCA啟動(dòng)子目標(biāo)片段中的DNA甲基化水平上調(diào)，從而降低從T2DM小鼠模型中提取而來的脂肪來源干細(xì)胞中CALCA的表達(dá)[16]。這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果不符，有待進(jìn)一步行基因檢測(cè)證實(shí)CALCA與T2DM發(fā)生的相關(guān)性。

miRNA是非編碼RNA，其主要通過miRNA的5′UTR與RNA靶序列的3′UTR結(jié)合，從而導(dǎo)致RNA靶序列降解或翻譯抑制[17]。研究表明，miRNA的失調(diào)是多種疾病發(fā)病機(jī)理的重要組成部分[18]。本研究在T2DM中鑒定出67個(gè)差異miRNA，包括66個(gè)下調(diào)的miRNA和1個(gè)上調(diào)的miRNA。miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，miRNA-16-5p是下調(diào)最明顯的miRNA之一，其靶向調(diào)控丙酮酸脫氫酶。丙酮酸脫氫酶是丙酮酸脫氫酶/支鏈酮酸脫氫酶激酶蛋白激酶家族的成員，是具有組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的線粒體蛋白。該蛋白位于線粒體的基質(zhì)中，PDK4通過丙酮酸脫氫酶亞基A1和A2的磷酸化，抑制丙酮酸脫氫酶復(fù)合物形成，從而在葡萄糖、脂肪酸代謝和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[19]。研究表明，PDK4參與胰島素信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過對(duì)丙酮酸脫氫酶活性的調(diào)節(jié)，在維持正常的血糖水平、血液pH值和酮體，以及調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和生物合成中起重要作用[20]。此外，還有研究顯示，肥胖和T2DM患者肌肉組織中的PDK4 mRNA表達(dá)增加，從而影響胰島素生成[21]。2008年，Rasche等[22]對(duì)人類和小鼠中多個(gè)組織的213個(gè)T2DM基因集進(jìn)行了薈萃分析，同樣發(fā)現(xiàn)PDK4參與了T2DM的發(fā)生。以上發(fā)現(xiàn)與我們預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致。

此外，miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，miRNA-103a-3p、miRNA-107與miRNA-15b-5p可能起到協(xié)同靶向PDK4的作用。最近有學(xué)者在關(guān)于肥胖患者手術(shù)前后miRNA的差異研究中，同樣鑒定出了miRNA-16-5p作為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要一員[23]。Tang等[24]首先將miRNA-107與糖尿病和葡萄糖代謝聯(lián)系起來，提出miRNA-107的失調(diào)可以導(dǎo)致炎癥、肥胖與胰島素抵抗的發(fā)生。另外，一項(xiàng)針對(duì)miRNA與T2DM的研究也表明，miRNA-107在肥胖癥和T2DM患者中表達(dá)明顯失調(diào)[25]。由此可見，miRNA-16-5p、miRNA-103a-3p、miRNA-107與miRNA-15b-5p等miRNA可能在T2DM的病理生理過程中起到關(guān)鍵作用。

總之，通過全面的生物信息學(xué)分析，共篩選出了與T2DM有關(guān)的40個(gè)差異表達(dá)mRNA和67個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中核心基因SCTR、TSHR、CALCA，以及miRNA-16-5p、miRNA-103a-3p、miRNA-107與PDK4的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能為T2DM的診斷和治療提供新的線索。