亞低溫治療對膿毒癥小鼠血清可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體1及炎癥因子水平的影響▲

石齊芳 楊光耀 李言鵬 王樹云 盛 鷹

(上海市浦東醫(yī)院急危重醫(yī)學(xué)科，上海市 201399，電子郵箱：shiqifang456@163.com)

低溫可以減緩機(jī)體的代謝，降低氧耗，保護(hù)線粒體功能，減少缺血缺氧所致的細(xì)胞凋亡以及自由基產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)[1]。膿毒癥是宿主對感染反應(yīng)失控的結(jié)果，對膿毒癥患者采用低溫療法可能有一定的效果[2]。但有關(guān)亞低溫用于治療膿毒癥效果的研究結(jié)果并不一致[3-4]，其中有臨床研究顯示亞低溫并不能改善膿毒癥/膿毒癥休克患者的預(yù)后[5-7]。髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體1( triggering receptor expressed on myeloid cell 1,TREM-1)是一種新型炎癥激發(fā)細(xì)胞膜受體，在炎癥觸發(fā)和級聯(lián)放大的反應(yīng)中作用突出。可溶性TREM-1(soluble TREM-1,sTREM-1)是TREM-1的可溶形式，在膿毒血癥中得到了廣泛的研究[8]。但亞低溫對膿毒癥患者sTREM-1水平的影響鮮見研究報告。本研究利用脂多糖腹腔注射方法建立膿毒癥小鼠模型，觀察34℃～36℃干預(yù)性亞低溫治療對膿毒癥小鼠炎癥因子水平及sTREM-1水平的影響，探討亞低溫療法調(diào)控膿毒癥小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體級7周齡BALB/c雌性小鼠84只，體質(zhì)量20～25 g，由中科院斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[許可證號：SYXK(滬)2015-001]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1～2周。

1.2 分組與建模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、膿毒癥組、亞低溫組，每組28只。膿毒癥組和亞低溫組采用腹腔注射10 mg/kg脂多糖建立膿毒癥小鼠模型，正常對照組給予腹腔注射同等劑量的生理鹽水。建模方法[9]：(1)用生理鹽水將脂多糖稀釋成1 mg/mL；稱重小鼠后剃除其下腹體毛，暴露表皮，用70%的酒精消毒后于下腹部偏外側(cè)注射脂多糖或生理鹽水。注射脂多糖后小鼠出現(xiàn)活動減少、寒戰(zhàn)、抱團(tuán)取暖、拒絕食水、抓取時逃避無力、呼吸頻率加快等說明造模成功。造模成功后1 h采用小鼠肛溫儀(北京鴻鷗成運(yùn)儀器公司，型號：TH-212)測量肛溫，正常對照組和膿毒癥組小鼠正常飲食，不給予任何處理，亞低溫組給予物理降溫法降溫，使小鼠肛溫維持在34℃～36℃。肛溫波動在0.5℃～1.0℃之間。本研究經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(審批文號：2017-D26)。

1.3 觀察指標(biāo) (1)分別于建模后6、12 h，采用隨機(jī)數(shù)字表法每組各取8只小鼠，取眼眶血1.0 mL置于普通試管，放于4℃冰箱中保存2 h，使用離心機(jī)以4 000 r/min常溫離心15 min，取上清液置于EP管中，放置于-80℃冰箱保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、sTREM-1水平，試劑盒均購自華美生物工程有限公司，操作按說明書進(jìn)行。于建模后12 h，采集血液標(biāo)本后處死小鼠，剖開腹腔觀察腸黏膜情況，如腸黏膜、腹腔臟器充血水腫，再次證明建模成功，本研究膿毒癥組和亞低溫組小鼠均建模成功。(2)建模成功后12 h，觀察每組其余20只小鼠的存活率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠血清TNF-α、IL-6、sTREM-1水平的比較 建模后6、12 h，與正常對照組相比，膿毒癥組和亞低溫組小鼠血清TNF-α、IL-6、sTREM-1水平升高，且膿毒癥組高于亞低溫組(均P<0.05)，見表1。

表1 3組小鼠血清TNF-α、IL-6、sTREM-1水平比較(x±s， ng/L)

2.2 3組小鼠建模后12 h生存情況的比較 正常對照組、膿毒癥組和亞低溫組小鼠存活率分別為100.0%(20/20)、35.0%(7/20)、55.0%(11/20)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.091,P<0.001)，正常對照組小鼠存活率高于膿毒癥組和亞低溫組(P<0.05)，但亞低溫組與膿毒癥組存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間動態(tài)平衡的破壞，可能是膿毒癥發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制[10]。在膿毒癥早期，炎癥介質(zhì)可在1～6 h內(nèi)迅速升高達(dá)到高峰，部分在12 h達(dá)到高峰，之后迅速下降， TNF-α是膿毒癥啟動時最早出現(xiàn)也是最重要的炎癥因子，可迅速達(dá)到峰值，并進(jìn)一步促進(jìn)IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的大量釋放。IL-6主要由IL-1、TNF-α誘導(dǎo)釋放，持續(xù)時間持久，是反映膿毒癥病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[11]。TREM-1是一種在中性粒細(xì)胞、成熟的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的免疫受體，是一種重要的膿毒癥免疫反應(yīng)的中介分子，其可促進(jìn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[12]。sTREM-1為TREM-1的可溶形式，TREM-1的水平越高相應(yīng)的sTREM-1的水平越高。越來越多的研究表明TREM-1是膿毒癥的重要標(biāo)志物，對診斷和評估預(yù)后具有重要意義[13]。有研究顯示，TREM-1抑制劑可以減輕膿毒癥模型大鼠的炎癥反應(yīng)，保護(hù)器官功能，維持血流動力學(xué)穩(wěn)定，延長膿毒癥大鼠的存活時間[14-15]。

有實(shí)驗(yàn)研究表明，體溫管理可以影響膿毒癥炎癥介質(zhì)的變化。例如，Ding等[3]利用盲腸結(jié)腸穿孔法建立膿毒癥大鼠模型，并觀察亞低溫治療膿毒癥大鼠的療效，結(jié)果顯示亞低溫(34℃)治療的膿毒癥大鼠IL-6、高遷移率族蛋白B1水平低于體溫維持在38℃的膿毒癥大鼠，24 h生存率更高；Léon 等[16]也發(fā)現(xiàn)，亞低溫(34℃)能降低膿毒癥大鼠血漿TNF-α和IL-6水平，抑制促炎反應(yīng)；而Rim等[4]發(fā)現(xiàn)治療性亞低溫(30℃～32℃)對嚴(yán)重膿毒性休克大鼠具有良好的治療作用，但對中度膿毒癥大鼠無明顯保護(hù)作用。這些動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示亞低溫對膿毒癥有潛在的治療作用。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠的血清TNF-α、IL-6及sTREM-1均較正常小鼠升高，而給予亞低溫干預(yù)后，膿毒癥小鼠的TNF-α、IL-6及sTREM-1水平均降低(P<0.05)，提示適當(dāng)?shù)牡蜏乜梢种苾?nèi)毒素所致的機(jī)體過度炎癥反應(yīng)；但亞低溫組小鼠存活率與膿毒癥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示亞低溫治療對膿毒癥小鼠存活率的影響還需進(jìn)一步研究。

但嚙齒動物模型和人類膿毒癥表型仍有差異，將動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果外推到膿毒癥患者上，仍需要更多的研究支持[17]，且近期的臨床研究并沒有取得預(yù)期效果。例如Mourvillier等[7]報告亞低溫(32℃～34℃，48 h)并不能改善重癥細(xì)菌性腦膜炎患者的預(yù)后，甚至可能有害，并提出在亞低溫試驗(yàn)中需仔細(xì)評估安全性問題。Gao等[5]將核心體溫≥39℃的膿毒癥患者隨機(jī)分為低溫組(36.5℃～38℃)和高溫組(38.5℃～39.5℃)，處理后6 h內(nèi)達(dá)到相應(yīng)靶核溫度并維持24 h，結(jié)果顯示低溫組患者的促炎細(xì)胞因子水平降低，但是生存率也降低，提示過度的溫度控制可能對膿毒癥患者有害。一項(xiàng)隨機(jī)、對照、開放性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在呼吸機(jī)依賴型呼吸衰竭的膿毒癥休克患者中，誘導(dǎo)性低溫并不能降低死亡率，且有可能延遲幾個關(guān)鍵器官功能的恢復(fù)[6]。臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果存在較大差異，主要原因可能是人體體溫的降低通常需要數(shù)小時來誘導(dǎo)，這時可能已經(jīng)發(fā)生組織損傷；另外動物模型所納入的動物大多數(shù)屬于幼齡，而膿毒癥患者以老年人居多，這種年齡的差異可能也是導(dǎo)致研究結(jié)果不盡一致的原因[3]，但還有待研究證實(shí)。

綜上所述，亞低溫治療能降低膿毒癥小鼠血清sTREM-1及炎癥因子水平，減輕炎癥反應(yīng)。然而，如何使膿毒癥患者從溫度管理中獲益，目前仍然缺乏令人信服的證據(jù)[18]，亞低溫治療對膿毒癥的影響需更多的研究來闡明。