宮腔粘連大鼠模型的構建以及二甲雙胍對模型大鼠生育能力的改善作用▲

江 梅 姜經航 邵 帥 王 洋 丁 濤

(湖北省荊門市第二人民醫院生殖醫學中心，荊門市 448000，電子郵箱：124558444@qq.com)

宮腔粘連是人工流產、診斷性刮宮等宮腔操作的常見并發癥，可導致繼發不孕和反復流產[1]。病理學研究結果表明子宮內膜纖維化參與宮腔粘連形成，可有效降低子宮內膜纖維化程度或有助于治療宮腔粘連[2-3]。二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線用藥。研究顯示，二甲雙胍通過抑制轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)促使細胞外基質合成的相關蛋白表達下調，從而發揮抗纖維化的效應[4]。目前，尚未發現將二甲雙胍應用于治療宮腔粘連的研究報道。本研究通過構建大鼠宮腔粘連模型，觀察口服二甲雙胍在促進子宮內膜修復、恢復生育能力方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周性成熟雌性SD大鼠45只，體重150～200 g，9～10周性成熟雄性SD大鼠15只，體重400～530 g，購于湖北省實驗動物中心(SCXK2015-0018)。飼養條件：普通級別，自然光線，室溫維持在24℃～26℃，定期消毒。

1.2 主要試劑及儀器 TGF-β1抗體、Smad 3抗體、纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)抗體、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)抗體以及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)、二抗均購于英國Abcam公司(批號分別為：ab215715、ab95455、ab2413、ab32575、ab181603、ab205719)，含蛋白酶抑制劑的裂解液(批號：P0013B)、DC蛋白鑒定試劑盒(批號：P10012S)均購自碧云天公司， TRIzol試劑購于美國Thermo公司(批號：1218355)，逆轉錄試劑盒(批號：639547)、PCR試劑盒(批號：RR037A)以及TGF-β1、Smad 3、FN、α-SMA、內參GAPDH基因引物(見表1)均購自大連Takara公司。SMZ800N型倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，ABI7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，041BR128118型雙向電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

表1 引物序列

1.3 實驗方法

1.3.1 刮宮聯合感染法構建宮腔粘連大鼠模型：取30只SD雌性大鼠，采用隨機數字表法將其分為對照組和造模組各15只。使用1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg)腹腔注射，麻醉成功后將SD大鼠固定于手術臺上。于造模組大鼠宮頸上方約5 mm處作縱行切口，長度約4 mm，采用自制大鼠宮腔刮勺經宮頸上方切口行刮宮術，待宮腔四壁出現粗糙感時停止刮宮；將浸泡于10 mg/mL脂多糖生理鹽水24 h后的棉線分別置于左側及右側宮腔，并將棉線穿過腹部切口固定于皮膚，逐層關腹，48 h后抽出宮腔置留線。對照組僅行腹部切口、開腹及關腹手術，不對宮腔進行任何操作。大鼠蘇醒后繼續飼養。術后給予大鼠肌肉注射青霉素20萬IU/d，1次/d，連續3 d。分別于術后第7天、第14天以及第21天，使用1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg)麻醉后采用頸椎快速脫臼法處死各組大鼠各5只，切開下腹部，暴露并切除子宮；將每只大鼠子宮組織分為2份，1份標本常規4%甲醛固定、石蠟包埋，另1份使用液氮冷凍。

1.3.2 蘇木素-伊紅染色：石蠟切片在二甲苯Ⅰ中脫蠟20 min后放入二甲苯Ⅱ中脫蠟20 min；脫蠟后的切片依次浸入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、75%乙醇及自來水中各浸泡5 min；蘇木精染色3 min；1%鹽酸酒精分化片刻，自來水沖洗 1 min；1%氨水返藍,自來水沖洗1 min；伊紅染色5 min，自來水洗去多余的染液；依次通過 75%乙醇5 s，95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ和 100%乙醇Ⅱ脫水各5 min；在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分別浸泡20 min；中性樹膠封固，晾干保存。于高倍顯微鏡下觀察，每份子宮組織選取5個視野，計數大鼠子宮內膜腺體數量，取5個視野的平均值作為大鼠子宮內膜腺體計數。用Image-ProPlus 6.0軟件測量切片子宮內膜厚度(子宮內膜肌層交接處至宮腔的垂直距離)，取5個視野的平均值作為子宮內膜厚度。

1.3.3 Masson染色：石蠟切片脫蠟、水化，Masson復合染液染色，2%醋酸水溶液稍洗，5%磷鎢酸分化5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸片刻，亮綠染色液5 min，0.2%醋酸水洗片刻2次，無水乙醇脫水10 s，二甲苯透明2 min，中性樹膠封固。于高倍顯微鏡下觀察，每份子宮組織選取5個視野，計算大鼠子宮內膜纖維化面積所占子宮內膜面積的比例，取5個視野的平均值。

1.3.4 免疫印跡法檢測相關蛋白質的表達：待檢測的組織用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗后，用含蛋白酶抑制劑的裂解液進行裂解，使用DC蛋白鑒定試劑盒測定蛋白含量，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉膜到纖維尼綸膜上。使用5%蛋白封閉液室溫封閉3 h。阻斷非特異的結合位點后，加入抗TGF-β1(1 ∶1 000)、Smad 3(1 ∶5 000)、FN(1 ∶5 000)、α-SMA(1 ∶1 500)和GAPDH(1 ∶10 000)的抗體在4℃孵育過夜，洗膜后用過氧化物酶連接的二抗(Abcam公司，ab205719)孵育1.5 h后，用增強化學發光發顯示蛋白帶，然后檢測灰度值。以GAPDH為內參，實驗重復3次。采用Image Lab 5.0圖像分析軟件計算目的蛋白的相對表達量。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達：使用TRIzol試劑盒提取子宮組織總RNA，紫外分光光度法測定RNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。按照試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。實時熒光定量PCR反應體系(冰上配制)共20 μL，包括SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μL、上游引物(10 μM)0.8 μL、下游因素(10 μM)0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、DNA模板2.0 μL、dH2O(滅菌蒸餾水)6.0 μL。實時熒光定量PCR反應條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，50℃ 15 s。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算TGF-β1、Smad 3、FN、α-SMA的mRNA相對表達量。

1.3.6 二甲雙胍對宮腔粘連大鼠生育能力的影響：取另15只SD雌性大鼠，根據隨機數字表法分為對照組、造模組、造模+二甲雙胍組各5只。按照1.3.1中的步驟，對造模組、造模+二甲雙胍組大鼠進行造模，對照組僅行腹部切口、開腹及關腹手術，不對宮腔進行任何操作。造模14 d后，造模+二甲雙胍組開始給予二甲雙胍300 mg/(kg·d)灌胃，對照組和造模組給予同等劑量的生理鹽水灌胃，均為1次/d，連續服用4周。服藥4周后，根據動情周期分別將這15只雌性大鼠和15只雄性大鼠按照1 ∶1比例合籠，次日早晨檢查陰道栓，有陰道栓為交配成功，計為妊娠0.5 d。于13.5 d后處死大鼠，評估和記錄雌性大鼠的孕囊數，其中未孕子宮為白色且呈線狀，而妊娠子宮則呈管狀，含有胚胎的部分則更膨大。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組設計t檢驗，多組之間及組內比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 對照組和造模組子宮內膜腺體數量的比較 隨著造模時間的延長造模組子宮內膜腺體數量呈下降趨勢，且各時間點的子宮內膜腺體數量均少于對照組(均P<0.05)，見表2。

表2 對照組和造模組子宮內膜腺體數量的比較 (x±s，個)

2.2 對照組和造模組子宮內膜厚度的比較 隨著造模時間的延長造模組子宮內膜厚度呈變薄趨勢，且各時間點的子宮內膜厚度均薄于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 對照組和造模組子宮內膜厚度的比較(x±s,nm)

2.3 對照組和造模組子宮內膜纖維化面積百分比的比較 隨著造模時間的延長造模組子宮內膜內膜纖維化面積百分比呈增加趨勢，且各時間點的百分比均大于對照組(均P<0.05)，見表4。

表4 對照組和造模組子宮內膜纖維化面積百分比的比較(x±s，%)

2.4 對照組和造模組子宮組織TGF-β1、Smad 3、FN以及a-SMA mRNA表達量的比較 與對照組比較，造模組各時間點子宮內膜組織TGF-β1、Smad 3、FN以及α-SMA的mRNA相對表達水平均上調，且隨著造模時間的延長相對表達量均呈上升趨勢(均P<0.05)，見表5。

表5 對照組和造模組子宮內膜TGF-β1 、Smad 3、FN以及α-SMA mRNA的相對表達水平的比較(x±s)

組別nFN mRNA 第7天第14天第21天F值P值α-SMA mRNA 第7天第14天第21天F值P值對照組5 1.00±0.011.00±0.021.00±0.010.6500.5551.01±0.011.00±0.011.00±0.01 1.000 0.420造模組51.79±0.253.04±0.07a4.42±0.38ab16.4580.0042.00±0.033.09±0.11a4.11±0.15ab251.537<0.001 t值6.32853.81618.18275.28337.50941.467P值0.008<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.5 對照組和造模組子宮內膜組織TGF-β1、Smad 3、FN以及α-SMA蛋白的表達量的比較 與對照組比較，造模組各時間點子宮內膜組織TGF-β1、Smad 3、FN以及α-SMA蛋白的相對表達水平均升高(均P<0.05)；并且隨著造模時間的延長，造模組TGF-β1以及Smad 3蛋白的相對表達水平呈上升趨勢(均P<0.05)，但造模第21天的FN以及α-SMA蛋白的表達水平與第14天比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表6及圖2。

表6 對照組和造模組子宮內膜TGF-β1 、Smad 3、FN以及α-SMA 蛋白的相對表達水平的比較(x±s)

組別nFN 蛋白 第7天第14天第21天F值P值α-SMA 蛋白 第7天第14天第21天F值P值對照組5 1.351±0.0711.449±0.0391.347±0.0244.208 0.0720.885±0.0290.911±0.0541.040±0.157 2.1760.195造模組56.576±0.1969.129±0.454a8.392±0.161a57.566<0.0011.232±0.0802.800±0.150a3.468±0.275a113.268<0.001 t值43.46929.22174.9767.07920.49013.261P值<0.0010.001<0.0010.002<0.0010.001

圖2 對照組和造模組大鼠各時間點子宮內膜組織TGF-β1、Smad 3、FN以及α-SMA蛋白的表達情況

2.6 3組大鼠子宮內孕囊數的比較 經檢查，所有的SD雌性大鼠合籠后均可見陰道黏液栓，說明交配成功。對照組、造模+二甲雙胍組、造模組大鼠的子宮內孕囊數依次降低(均P<0.05)，見表7。

表7 3組大鼠子宮內孕囊數的比較(x±s，個)

3 討 論

宮腔粘連又被稱為Asherman綜合征，目前認為其發生主要與宮腔內操作、宮腔內感染等因素有關。此外，細胞因子打破細胞外基質合成與降解的平衡，也會導致子宮內膜纖維化并促進粘連形成[5]。本研究采用搔刮宮腔法結合脂多糖制造感染性因素，構建大鼠宮腔粘連模型。結果顯示，與對照組大鼠比較，造模組大鼠的子宮內膜腺體數量減少，子宮內膜變薄，纖維化程度加重(P<0.05)；并且隨著造模時間的延長，造模組大鼠的子宮內膜腺體數量減少、子宮內膜厚度變薄以及纖維化程度均加重。這提示大鼠宮腔粘連模型構建成功，該建模方法操作簡單，對內膜損傷明顯，模型相對穩定。

病理學研究表明，細胞外基質纖維蛋白原聚集可導致子宮內膜組織出現纖維化，而TGF-β1是目前引起器官纖維化最重要的細胞因子之一，其在子宮內膜中呈現高表達，導致TGF-β/Smad信號通路被激活，進而能夠激活下游促纖維化蛋白的表達，加重細胞外基質的堆積，促進纖維化加重[6-8]。因此，在本研究中，宮腔粘連大鼠子宮組織的TGF-β1、Smad 3、FN及α-SMA的基因和蛋白水平均呈高表達，并且隨著造模時間的延長，TGF-β1以及Smad 3的相對表達量也隨之上升(P<0.05)，但是在造模第21天的FN和α-SMA蛋白的表達水平與第14天比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

宮腔粘連最為嚴重的后果是繼發不孕和反復流產。目前，針對宮腔粘連主要采取以手術為主的綜合性治療，包括激素調節治療聯合宮腔內放置節育器、球囊、防粘連劑，或者經血干細胞宮腔灌注[9-10]，但是仍存在復發率高、妊娠情況改善不明顯的缺點[11]。在四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化模型中發現二甲雙胍能夠通過抑制TGF-β1/Smad信號通路降低肝臟纖維化程度[12]。故我們認為，二甲雙胍有可能通過抑制TGF-β1/Smad 3來改善大鼠宮腔纖維化程度，進而影響大鼠的生育力。本研究結果顯示，造模+二甲雙胍組和造模組大鼠孕囊數量少于對照組，但造模+二甲雙胍組的數量均多于造模組(均P<0.05)，這表明二甲雙胍能夠在一定程度上改善宮腔粘連大鼠的生育能力。

綜上所述，刮宮聯合感染法能夠構建穩定的宮腔粘連大鼠模型，為后續進行相關機制研究提供了動物模型；同時，二甲雙胍能夠改善宮腔粘連大鼠的生育能力。