表沒食子兒茶素沒食子酸酯對牙齦卟啉單胞菌細菌毒力抑制作用的體外研究

齊霞， 孔令雪， 李淑娟， 馬思婷， 齊雅麗， 趙蕾

1. 河北醫科大學口腔醫學院·口腔醫院牙周一科，河北省口腔醫學重點實驗室，河北省口腔疾病臨床醫學研究中心，河北 石家莊（050017）； 2.濟南口腔醫院牙周黏膜科，山東 濟南（250001）； 3.口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫學研究中心 四川大學華西口腔醫院牙周科，四川 成都（610041）

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周炎的主要致病菌。P. gingivalis 參與形成齦下菌斑生物膜，通過改變生物膜的組成及負荷，引起菌群失調，與牙周疾病的發生發展及治療失敗相關［1?3］。P. gingivalis 可分泌牙齦素等毒力因子直接破壞牙周組織［4］，同時，還可入侵宿主細胞使其釋放大量炎癥因子，如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），導致牙周組織的繼發性損傷［5?7］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocate?chin?3?gallate，EGCG）是綠茶兒茶酸中最主要成分，占其總重的59%。研究顯示每天飲用1 杯綠茶，可顯著降低牙周病的發病率及嚴重程度［8］。用P.gin?givalis 感染小鼠構建牙周炎動物模型，口腔內注射40 mg/kg 的EGCG 溶液4 周發現，實驗組牙周組織炎癥顯著減輕，且血液中上調的白介素?1β（interleukin?1β，IL?1β）表達水平顯著降低［9］，提示EGCG 可減輕P.gingivalis 引起的牙周炎癥，但其具體機制仍有待深入探究。本研究探討EGCG 對P. gingivalis 生物膜、毒力因子的抑制作用及EGCG 對P. gingivalis 刺激的人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）分泌MMPs的能力。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

EGCG（杭州禾田生物制品有限公司）；P. gin?givalis ATCC33277 由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供；心腦浸出液培養基（brian heart infusion，BHI）（Oxiod，英 國）；XTT 試 劑 盒（Syn?chem，美國）；精氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（argi?nine gingipain，Rgp）特異性產色底物、賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（lysine gingipain，Kgp）特異性產色底物、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）（Sigma，美國）；胎牛血清、DMEM 培養基（Hyclone，美國）；Trizol（Invitrogen，美國）；人MMP?1、MMP?1 ELISA試劑盒（優爾生科技股份有限公司，中國）；RNA 逆轉錄試劑盒、qRT?PCR 試劑盒（TakaRa，日本）。酶標儀（Thermo，美國）；掃描電鏡（Inspect FEI，荷蘭）；ABI7300 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，美國）。

1.2 EGCG 對P.gingivalis 浮游菌生長的影響

采用微量稀釋法梯度稀釋EGCG 并加入96 孔板 中 與1 × 108CFU/mL P. gingivalis 菌 懸 液 各100 μL 混合，使EGCG 終濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9 μg/mL，于37 ℃厭氧培養24 h 后，酶標儀A655nm測吸光度值，確定最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）及最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。另設不含EGCG的空白對照組。每組設3個平行孔。

1.3 EGCG 對P.gingivalis 生 物 膜 的 影 響

1.3.1 結晶紫染色法檢測EGCG 對P. gingivalis 生物膜形成的抑制作用 將P. gingivalis 菌懸液（100 μL 每孔）與不同濃度EGCG（100 μL 每孔）37 ℃厭氧共培養24 h，另設陽性對照組（100 μL BHI 及100 μL P. gingivalis 菌懸液），陰性對照組（200 μL BHI）以及藥物對照組（100 μL BHI 及100 μL 不同濃度EGCG）。結晶紫染色，酶標儀A550nm測量吸光度值。藥物最低生物膜抑制濃度（minimum biofilm inhibition concentration，MBIC）為與對照組相比，抑制50%或90%生物膜形成的最低 藥 物 濃 度，即MBIC50和MBIC90［10］。每 組 設4 個平行孔，實驗重復3 次。計算生物膜形成的相對形成率：生物膜形成相對抑制率=1-（實驗組A550nm-藥物組A550nm）/（陽性對照組A550nm-陰性對照組A550nm）×100%。

1.3.2 結晶紫染色法檢測EGCG 對P.gingivalis成熟生物膜的清除作用 P. gingivalis 菌懸液200 μL 培養24 h，形成成熟生物膜，PBS 洗去浮游菌后，加入200 μL微量液體稀釋法梯度稀釋后終濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9 μg/mL EGCG，分別設置陽性對照組（200 μL P.gingivalis菌懸液），陰性對照組（200 μL BHI）及藥物對照組（200 μL 不同濃度EGCG），繼續厭氧培養24 h 后，結晶紫染色，測量A550nm下的吸光度值。計算藥物最低清除已形成生物膜清除濃度（minimum biofilm reduction concentration，MBRC）［11］，即MBRC50和MBRC90。成熟生物膜相對清除率=1-（實驗組A550nm-藥物組A550nm）/（陽性對照組A550nm-陰性對照組A550nm）× 100%。

1.3.3 XTT 法檢測EGCG 對P. gingivalis 成熟生物膜活性的影響 在P. gingivalis 成熟生物膜中加入不同濃度EGCG，37 ℃厭氧培養24 h 后，每孔加入120 μL XTT?甲萘醌混合溶液，37 ℃黑暗培養2 h，測A490nm下的吸光度值。計算成熟生物膜活性的最小抑菌濃度（sessile minimal inhibitory concentration，SMIC）［12］，即SMIC50和SMIC90，固著狀態細菌活性相對抑制率=1-（實驗組A490nm-藥物組A490nm）/（陽性對照組A490nm-陰性對照組A490nm）× 100%。

1.4 掃描電鏡觀察EGCG 對P.gingivalis 成熟生物膜的清除作用

在24 孔板內放置無菌圓形玻片，EGCG 與P.gingivalis 成熟生物膜共培養24 h 后，2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯液置換，二氧化碳臨界干燥，離子濺射表面固定鍍膜致材料表面成金黃色，掃描電子顯微鏡（scanning electron micros?copy，SEM）觀察分析。

1.5 EGCG 抑制牙齦素的蛋白水解活性

收集P. gingivalis 并稀釋至Rgp 組P. gingivalis濃度為A660nm=2，Kgp 組為A660nm=1，4 ℃10 000 g 離心10 min 后，取上清液100 μL，依次加入50 μL 終濃度為0、10、50 μg/mL EGCG，25 μL 0.04 mol/L DTT 及濃度為0.016 mol/L Rgp 或Kgp 特異性產色底物，設無P. gingivalis 的為陰性對照組，將混合物37 ℃暗培養，分別于15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h 在酶標儀A490nm測量吸光度值。

1.6 HGFs 的原代培養

采用酶消化聯合組織塊法培養人原代牙齦成纖維細胞［7］，第4～6 代用于實驗。本研究已獲四川大學華西口腔醫院倫理委員會批準（批準號：WCHSIRB?ST?2012?067）。

1.7 MTT 法測定P.gingivalis 及EGCG 對牙齦成纖維細胞的細胞毒性

收集對數生長期HGFs 接種于96 孔板，并加入濃度為1、10、50、100、250、500 μg/mL EGCG 或感染復數為50、100、200、250、500 的P. gingivalis，培養24 h 后，依次加入20 μL MTT 及200 μL DMSO，測量并計算細胞存活率。另設不含EGCG 的空白對照組及不含細胞的陰性對照組。

1.8 細胞培養及處理

接種5×105個/mL 的HGFs 于6 孔板，培養24 h；同時，加入P. gingivalis（MOI 值為200）及終濃度為50 μg/mL 和10 μg/mL 的EGCG。另設不含P. gingi?valis 或EGCG 的對照組。37 ℃、體積分數為5%CO2恒溫細胞培養箱內共培養24 h。11 000 g 離心10 min 收集細胞上清液?20 ℃凍存。

1.9 ELISA 法檢測MMP?1 及MMP?2 的蛋白分泌量

采用BCA 蛋白濃度試劑盒測定總蛋白濃度，ELISA 試劑盒檢測HGFs 細胞培養上清液中MMP?1及MMP?2 的含量。

1.10 qRT?PCR 分 析P. gingivalis 感 染 的HGFs 中MMP?1，MMP?2 mRNA 的表達

Trizol 法提取HGFs 總RNA，分光光度計測定總RNA 濃度及純度。Takara 試劑盒逆轉錄RNA為cDNA，進行qRT?PCR 定量分析。引物序列見表1。擴增條件：預變性（95 ℃30 s）1 個循環；PCR 反應（95 ℃變性5 s，60 ℃31 s）40 個循環，終止反 應（95 ℃5 s；60 ℃30 s；95 ℃15 s）1 個循環。按照2?△△Ct法計算各組的目的基因相對表達量。

表1 qRT?PCR 反應中引物序列Table 1 The primers sequence of the genes used in qRT?PCR

1.11 統計學分析

采用SPSS 21.0 對數據進行統計學分析，定量資料以均數± 標準差（x ± s）表示，符合正態分布與方差齊性的采用單因素方差分析（ANOVA），若不符合采用Kruskal?Wallis 非參數檢驗，組間兩兩比較采用LSD 法檢驗或Dunnett's T3 檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EGCG 對P.gingivalis 浮游菌及生物膜的影響

將P. gingivalis ATCC33277 接種于BHI 血瓊脂平板，37 ℃厭氧培養24 h，光鏡下為革蘭氏陰性染色的球桿菌（圖1）。EGCG 對P. gingivalis 浮游菌MIC 和MBC 分別為62.5 μg/mL，500 μg/mL（表2）。7.8～125 μg/mL EGCG 對P.gingivalis 生物膜形成具有抑制作用，呈現劑量效應關系（P ＜0.05，圖2a）；其中，MBIC50為7.8 μg/mL，MBIC90為31.25 μg/mL。EGCG 對24 h 形成的P. gingivalis 生物膜表現出清除作用，MBRC50為250 μg/mL（圖2b）。125 μg/mL的EGCG 即可抑制50%固著狀態細菌活性，即SMIC50；62.5～1 000 μg/mL 的實驗組生物膜細菌活性均低于空白對照組，差異有統計學意義（圖2c，P ＜0.05）。掃描電鏡觀察結果顯示：與對照組相比，實驗組生物膜的量明顯減少，致密結構變得疏松多孔，1 000 μg/mL EGCG組細胞間幾乎無連接（圖3）。

圖1 P. gingivalis ATCC33277 菌株培養（×1 000）Figure 1 Culture of P. gingivalis ATCC33277（×1 000）

表2 EGCG 對P. gingivalis 浮游菌及生物膜的作用Table 2 Effects of EGCG against P. gingivalis planktonic culture and biofilms

2.2 EGCG 對牙齦素蛋白水解活性的抑制作用

低于MIC 濃度的EGCG 均可抑制Rgp 對蛋白的降解作用（P ＜0.05），10、50 μg/mL 的EGCG 抑制率 分 別 為（49.92 ± 6.41）%，（69.56 ± 3.62）%（圖4a），且10、50 μg/mL EGCG 對Rgp 蛋白降解抑制作用在1、2、3、4 h 組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）（圖4b）。P. gingivalis Kgp 蛋白水解活性同樣被抑制（P ＜0.05），抑制率分別為（37.50 ± 1.91）%和（49.40 ± 3.61）%，50 μg/mL EGCG 對Kgp 蛋白降解抑制作用在3、4 h 組間比較無統計學意義（P＞0.05）（圖4c、4d）。

2.3 P. gingivalis 及EGCG 對HGFs 細胞活性影響

與對照組相比，P. gingivalis 在MOI 值250∶1 及500∶1 時對HGFs 的生長有抑制作用（P ＜0.05，圖5a）。500 μg/mL EGCG 抑制HGFs 的生長，250 μg/mL 及以下濃度EGCG 對HGFs 細胞存活無影響（圖5b）。

2.4 EGCG 對P. gingivalis 刺激下HGFs 表達MMP?1、MMP?2 水平的影響

與陰性對照組相比，陽性對照組MMP?1 和MMP?2 的分泌分別上升了1.4 倍和1.6 倍。與陽性對照組相比較，50 μg/mL EGCG 實驗組HGFs 上清液中MMP?1 和MMP?2 的分泌被抑制（P ＜0.05），而10 μg/mL EGCG 對其無明顯抑制作用（圖6a、6b）。

Figure 2 Inhibitory effect of different concentrations of EGCG on P. gingivalis biofilm圖2 不同濃度EGCG 對P. gingivalis 生物膜的抑制作用

Figure 3 Effect of the EGCG concentration on the mature biofilms of P. gingivalis using SEM（× 10 000）圖3 SEM 觀察不同濃度EGCG 對P. gingivalis 成熟生物膜的影響（× 10 000）

Figure 4 Effect of EGCG on P. gingivalis Rgp and Kgp activities圖4 EGCG 對P. gingivalis Rgp 及Kgp 蛋白水解活性的影響

qRT?PCR 結果顯示：與陽性對照組相比，50 μg/mL EGCG 可顯著抑制P. gingivalis 刺激HGFs 后MMP?1 和MMP?2 mRNA 水平升高（P ＜0.05），10 μg/mL 和50 μg/mL 的EGCG 對MMP?1 mRNA 表達的抑制率分別為（28.3 ± 6.58）%和（50.69 ± 6.95）%（P ＜0.05），50 μg/mL 的EGCG 對MMP?2 mRNA 表達的抑制率為（62.92 ± 11）%（圖6c、6d）。

Figure 6 Effect of EGCG on the secretion of MMP?1 and MMP?2 by HGFs stimulated by P. gingivalis圖6 不同濃度EGCG 對P. gingivalis 刺激后HGFs 表達MMP?1 及MMP?2 的影響

3 討 論

綠茶兒茶素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，其主要成分EGCG 抗菌作用最強且抗菌譜廣［13］。EGCG 可在細胞質膜的脂質層中產生過氧化氫，導致細胞的裂解［14］；螯合細菌生長必須的鐵離子，造成菌體營養缺乏［15］。此外，EGCG 還可抑制細胞質二氫葉酸還原酶，從而抑制核酸前體的合成［16］。EGCG 對牙周炎主要致病菌P.gingivalis有抗菌作用，MIC為31.25～500 μg/mL［17?20］。本研究結 果 顯 示：EGCG 抑 制P. gingivalis ATCC 33277 浮游菌的生長，MIC 為62.5 μg/mL。

菌斑生物膜形成和成熟是牙周病發生的關鍵，且成熟生物膜中細菌活性更高，較浮游菌對抗生素或宿主防御功能的抵抗作用更強。因此，抑制生物膜形成、清除成熟生物膜和抑制成熟生物膜活性三個方面能較全面反應藥物對菌斑生物膜的影響。本研究發現：低于MIC 濃度的EGCG 對P.gingivalis 生物膜的形成有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴效應關系。以上結果與Ben 等［15］結果類似，在不對細菌生長產生顯著影響的前提下，EGCG 可抑制具核梭桿菌生物膜的形成。本研究發現EGCG 對已形成的P. gingivalis 生物膜具有清除作用，掃描電鏡分析發現EGCG 改變P. gingivalis成熟生物膜的結構，生物膜致密結構變薄且疏松，細菌量減少。此外，XTT 法檢測EGCG 對成熟生物膜 活 性 的 抑 制 作 用，SMIC50為125 μg/mL。Asahi等［21］通過激光共聚焦顯微鏡發現EGCG 處理組P.gingivalis 成熟生物膜中死菌的比例明顯高于對照組，進一步證實EGCG 可抑制成熟生物膜活性。根據以上結果推測：EGCG 可能通過抑制P. gingivalis的黏附，初步抑制生物膜的形成。此外，EGCG 可抑制成熟生物膜的活性并對成熟生物膜有清除作用，形成疏松多孔的生物膜，利于免疫細胞、藥物等進一步滲透，并利于機械方法清除齦下菌斑。

多項體外研究證實，EGCG 可抑制細菌的毒力因子活性。變異鏈球菌是主要致齲菌，葡萄糖基轉移酶（glucosyltransferase，GTF）是變異鏈球菌重要的致病因子。EGCG 可抑制葡糖基轉移酶合成葡聚糖，阻礙細菌黏附形成菌斑生物膜［22］。此外，EGCG可抑制莫雷梭菌（Solobacterium moorei，S moorei）表達β?半乳糖苷酶基因，從而減少與口臭相關揮發性硫化物的產生［23］。牙齦素是P. gingivalis 最重要的毒力因子，參與攝取氨基酸，提供營養；促進細菌黏附共聚及菌毛成熟，形成菌斑生物膜［7，24?25］；降解細胞間黏附分子及多種細胞因子、補體成分，入侵宿主防御反應，最終導致牙周組織破壞［26?27］。研究發現EGCG 能抑制rgpA 和kgp 基因的表達，減少Rgp 和Kgp 的分泌［19］，但尚無對Rgp 和Kgp 活性的研究。本研究結果顯示：低于MIC 劑量的EGCG 可顯著抑制P. gingivalis 牙齦素Rgp 和Kgp 裂解特異性產色底物釋放顯色團P?硝基苯胺的水平。

宿主對牙周致病菌的免疫反應是造成牙周組織破壞的主要原因，牙周結締組織中最主要的細胞成分為HGFs，牙周致病菌主要通過刺激HGFs分泌MMPs，破壞細胞外基質穩態，引起牙周組織 破壞［28?30］。研究證實EGCG 可抑制伴放線放線桿菌?LPS［31］及牙齦卟 啉單胞菌?LPS［32］誘導HGFs分泌MMPs。本實驗采用P. gingivalis 直接刺激宿主HGFs 產生MMP?1 和MMP?2，在加入50 μg/mL EGCG 后，HGFs 中MMP?1 和MMP?2 的分泌及表達均下調。

日常綠茶飲品中兒茶素平均濃度為1 mg/mL［33］，EGCG 約500 μg/mL，足以抑制P. gingivalis的生長及生物膜的形成，此外，超聲震動不會引起EGCG 的明顯降解［34］。基于唾液的沖刷作用，難以保證EGCG 的有效抗菌濃度，50 μg/mL EGCG 仍可抑制P. gingivalis 毒力因子牙齦素，抑制P. gingiva?lis 誘導牙齦成纖維細胞表達MMPs。綜上所述，EGCG 可作為伴全身疾病的牙周炎輔助治療的潛在藥物。本課題組后續將建立動物模型，多方面證實EGCG 的抗菌及抗炎作用，以期為牙周炎的防治提供更多依據。

【Author contributions】Qi X and Kong LX performed the experi?ments，analyzed the data，and wrote and revised the article. Li SJ，Ma ST，Qi YL wrote and revised the article. Zhao L designed the study，wrote and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.