牙體組織粘接界面觀察分析方法的研究進展

馬超群， 劉猛， 仇珺， 廖紫璇， 周唯， 陳吉華

1. 口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心 軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室 陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室 第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院修復科，陜西 西安（710032）； 2. 口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心 軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室 陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室 第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西 西安（710032）

隨著口腔粘接修復技術的發(fā)展，牙科粘接技術與材料已被廣泛應用于牙科治療的各個領域。粘接效果的評價包括臨床觀察和實驗室檢測兩部分，實驗室檢測中對粘接修復材料與牙體硬組織結合界面的觀察分析是評價粘接效果的重要手段。根據研究目的不同，學者們開發(fā)出了多種用于粘接界面形貌性能觀察分析的方法。牙體組織粘接界面的觀察分析主要借助于各種顯微鏡。而在具體的檢測中，顯微鏡的功能又不僅限于一般的形貌觀察，還可以對物質的成分結構生物活性等進行檢測，甚至有些顯微鏡成像原理即為物質成分差異。根據對相關文獻的收集與整理，將目前最常用的粘接界面觀察分析的方法按照顯微鏡類型進行了分類敘述，其中也包括基于顯微鏡觀察的其他分析方法，如下。

1 掃描電子顯微鏡（scanning electron micrographs，SEM）

SEM 是一種通過收集電子束與試樣表面作用產生的信號生成圖像以達到對試樣表面形貌呈現的方法。電子束可使試樣5～10 nm 厚度的表層電離逸出大量二次電子。試樣某部位二次電子的產額與試樣表面的凹凸形貌以及成像的亮度正相關［1］。所以普通模式下的SEM 圖像特點為凸出的地方亮度高而凹陷的地方亮度低［2］。入射電子也有一部分會被試樣50～100 nm 厚度的表層反射成背散射電子。試樣某部位背散射電子的產額與該部位元素的原子序數高度成正相關。所以背散射模式下的SEM 圖像特點為元素原子序數高的區(qū)域亮度高，而原子序數低的區(qū)域亮度低［3］。這種模式適用于粘接界面納米滲漏的觀察，因為可以顯示銀離子的位置［4?5］。然而背散射模式下的SEM 成像分辨率要低于普通模式。

SEM 觀察樣本的制作分為兩步。第一，粘接試件制作，按照需求制備相應的粘接樣本，并通過切割或其他方法形成適當的形態(tài)；第二，電鏡樣本制作，根據需求樣本可經過或不經過固定、脫礦、脫膠原、超聲清洗、表面拋光、梯度脫水等處理，最后進行噴金。SEM 觀察深度較淺，其樣本制作對表面處理要求較高，但樣本表面經過切割會產生玷污層從而影響觀察。對于切割產生觀察面的樣本就需要去除玷污層，可以采用高度拋光或表面酸蝕的方法，或者根據需要僅保留部分結構，如用磷酸鹽及次氯酸去除全部牙體組織而僅保留樹脂結構［6?7］。抗酸堿層則可能需要更為負責的樣本表面處理方法［8］。

SEM 界面形態(tài)景深、視野大，立體效果好，能夠比較清晰地反映牙本質膠原纖維和樹脂的位置關系。此外還可利用SEM 相配套的X 線能譜儀（X?ray energy dispersive analysis，EDS）對界面結構的元素組成進行深入分析；但表面處理可能難以保證界面結構完全不受損傷。此外，在真空干燥環(huán)境中觀察會引發(fā)材料及組織收縮，產生裂縫影響觀察效果。針對干燥的問題也可用環(huán)境掃描電鏡（environmental scanning electron microscope，ESEM）進行觀察，但ESEM 分辨率不及SEM，使用仍具有一定局限性［9］。

2 透射電子顯微鏡（transmission electron micro?scope，TEM）

TEM 是一種通過收集電子束透過試樣后的電子信息，生成圖像以達到試樣微觀結構與成分分析的方法。TEM 觀察試樣通常為80～100 nm 的超薄切片［10］。TEM 較SEM 有更高分辨率，可觀察到試樣內部的超微結構，在粘接界面觀察中常應用于牙本質和混合層中膠原和礦物質或粘接樹脂之間的結構關系和界面納米滲漏的分析。

TEM 觀察樣本粘接制樣較SEM 復雜，需進行脫礦處理，并經過多重固定，梯度脫水，包埋，染色和超薄切片等步驟。TEM 觀察深入物質內部，可顯示界面的超微結構，將樹脂、膠原、礦物質的二維結構關系顯示較為清晰［9］。但與SEM 相比，TEM無法反映界面的立體結構，且由于是超薄切片，樣本制作的精細程度會對觀察效果產生明顯影響。

3 激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning mi?croscopy，CLSM）

CLSM 是一種在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖象處理，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針得到物質內部微細結構的方法。其所得圖像是標本的光學橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點［11］。

存在于粘接界面的能被探測到的熒光信號分為兩類。一類是外源性熒光，即熒光染料及熒光反應所形成的熒光信號；另一類是內源性熒光，即自發(fā)熒光。外源性熒光根據觀察目的不同有多種形式：①染料標記界面結構，即在粘接制樣過程中將熒光染料與粘接材料混合形成熒光標記的粘接材料，觀察時熒光可顯示粘接劑的位置，通過熒光信號反映粘接界面的形貌［12］；②染料滲透，即將粘接樣本浸入熒光染料溶液中，染料會進入封閉性差的界面滲漏位置，實現對界面完整性的評估［13］；③熒光反應，當發(fā)生特異性反應時，原本淬滅狀態(tài)的熒光劑被激活來探測目標物質在粘接界面的分布情況。如粘接界面原位酶譜檢測，即將淬滅狀態(tài)的熒光標記明膠溶液滴加在粘接試件上進行孵育，明膠酶活性增強時淬滅狀態(tài)的熒光標記明膠被水解產生熒光信號，從而對粘接界面膠原破壞情況進行研究［14］。此外，還可利用死/活菌熒光染色試劑，對粘接界面內及下方牙體組織中細菌進行染色，觀察致齲菌對粘接界面的破壞情況［15］。

內源性熒光則是粘接界面各物質結構在CLSM 激發(fā)光源的照射下所產生的熒光信號。據相關研究，健康及脫礦牙本質、粘接劑、復合樹脂、粘接劑混合層等都能發(fā)出不同強度的自發(fā)熒光信號，從而用于對界面不同結構的區(qū)分，可對粘接界面的破壞程度、早期齲等進行觀測［16?17］。

CLSM 樣本制備簡便，水不影響CLSM 掃描，可對正常濕度的試樣觀察，能保持樣本的原始狀態(tài)。CLSM 還可對樣本表面下一定深度的地方進行掃描，通過計算機重建獲得三維圖像。但外源性熒光可能會因為制樣過程產生一定的誤差，如染料的外溢或混合不均勻。內源性熒光能夠在一定程度上避免外源性染色所產生的誤差，但是作為一種新的觀察方法還有待研究。

4 拉曼光譜（raman spectroscopy，RS）

RS 作為一種分子振動譜線，其觀察原理為拉曼散射和拉曼位移。不同化學鍵或基團特有的分子振動能產生特異性拉曼位移。在拉曼光譜的結果圖中，X 軸代表拉曼位移，對應化學基團；Y 軸代表峰強度，和基團濃度呈正比。不同材料有特征性的拉曼光譜，可用于定性反映物質的組分和結構信息［18］。

常規(guī)粘接界面觀察樣本因切割會產生玷污層而影響RS 的定性分析。此時可通過高度拋光或酸蝕劑去除玷污層以增加拉曼分析的準確性。清除表面玷污層后便可直接進行觀察，無需干燥。當檢測靠近交界處的牙本質，若觀測到樹脂成分特征峰和牙體組織特征峰同時出現，證明樹脂已經滲入牙本質小管。此外，若以特征峰為峰強熱度值，可顯示不同結構成分在粘接界面的分布［19］。雖然RS 不是一種嚴格意義上的定量檢測手段，但可通過與正常牙本質及樹脂的譜圖進行對比，分析粘接劑對牙本質表面改造程度［3］。

相比于SEM 和TEM，RS 可通過分析化學成分變化精確反映界面結構，并可實現對粘接界面的多點連續(xù)監(jiān)測，獲得較為準確的界面結構成分變化情況［20?21］。

5 光學相干層析成像（optical coherence tomogra?phy，OCT）

OCT 通過光源的低相干光干涉原理和圖像處理技術的融合，分析組織對光源產生的背向散射光和另一束光源產生的干涉光得到樣品在不同深度的結構信息［22］。

在牙科領域，OCT 被首先用于對齲壞組織的觀察，齲壞脫礦部位的信號強度灰度較周圍正常牙本質高［23］。近年來，OCT 對粘接界面的觀察主要集中于對界面微滲漏的分析。用于填充缺陷的介質和材料主體之間的光學對比度，會導致反向散射信號的可檢測變化。作為缺陷區(qū)域，微滲漏的光學散射強度與其他部分有明顯差異，在OCT 圖像中，界面微滲漏表現為明顯的灰度增強區(qū)域。此外界面或其他位置出現如氣泡等較大缺陷，OCT圖像中則表現為灰度減小的信號中斷區(qū)域［24］。

OCT 成像具有非接觸性、無損傷性、成像速度快等優(yōu)點，觀測不受水分影響。由于不需要切割，樣本可反復使用，從而最大限度消除粘接耐久性檢測中由樣本誤差帶來的干擾。但由于組織自身導致的光學衰減，大多數組織中的OCT 成像深度在2～3 mm。OCT 的分辨率較低，難以對粘接界面的細微結構進行觀察。

6 原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）

AFM 通過探針與物體表面結構發(fā)生力學作用，重現物體表面細微結構。其納米級探針和微米級懸臂是成像的關鍵［25］，在測量時須注意對樣本表面機械性能進行預估以選擇適合的探針，對機械性能差異較大的不同結構進行連續(xù)檢測時，也須及時更換探針以獲得準確的測量結果，同時也避免儀器的損傷。其工作模式有接觸、非接觸和輕敲模式，牙本質粘接界面的結構分析常用輕敲模式。樣品制作時僅需按照說明進行。觀測面必須平整，因為AFM 只能處理表面一定高度變化，否則會產生低質量圖像甚至損壞探針。盡量保證拋光等制備技術的質量，從而可獲取最大分辨率［26］。

AFM 的輕敲模式可清晰地觀測到樹脂層、混合層、牙本質層、牙本質小管以及樹脂突等結構［27］。除觀測形貌外，AFM 還可通過對表面形貌進行三維分析，實現對牙本質小管直徑、深度以及表面粗糙度的測量［28］。這種直接測量得到的表面粗糙度可用于酸對牙釉質的侵蝕程度和粘接劑附著力的分析［26，29］。此外，AFM 與納米硬度計聯合使用可用于樣本表面納米機械性能的檢測，表面不同部位的力學性能差異以熱度值表示，分辨率可達納米級［30］。AFM 在牙齒硬組織表面結構形貌及性能分析中具有廣泛應用。在粘接界面觀測上，可盡量保存牙齒原貌，排除人為因素干擾，也不會受到樣品表面水膜和殘留的黏性粘接劑的影響，其多種模式也可適應不同環(huán)境。

7 小 結

以上6 種為目前評估粘接界面質量的最常用方法。SEM 在界面形貌觀察中最為常用；對于超微結構的觀察，如牙本質膠原、牙釉質釉柱晶體的觀察，則必須使用SEM 或TEM 這種高分辨率的顯微鏡；CLSM 常借助外源性染色對粘接材料在牙體組織中的分布及形態(tài)進行觀察；納米滲漏檢測中SEM 與TEM 均使用較多；微滲漏可用CLSM 熒光染料滲透法進行檢測；OCT 在微滲漏檢測中也有著良好的應用前景；對于界面結構成分的分析，可通過SEM 中的EDS 進行元素檢測，也可使用RS 對特征化學鍵和基團進行分析；粘接界面的物理特性，如機械性能、表面粗糙度則可通過AFM 及相應設備進行檢測。

【Author contributions】Ma CQ，Liu M wrote the article. Qiu J，Li?ao ZX collected the data. Zhou W，Chen JH revised the article. All au?thors read and approved the final manuscript as submitted.