基于介孔硅的姜黃素?siRNA 共遞送系統構建及其對巨噬細胞M2 型極化的影響

李沛漢， 郎凱， 宋文

1. 軍事口腔醫學國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫學研究中心，陜西省口腔醫學重點實驗室，空軍軍醫大學第三附屬醫院修復科，陜西 西安（710032）； 2. 空軍軍醫大學基礎醫學院學員二大隊七隊，陜西 西安（710032）

種植修復目前已逐漸成為口腔牙齒缺失的主要修復方式，其中種植體與骨組織間形成的骨結合是其發揮功能的生物學基礎［1］。巨噬細胞是介導固有免疫反應的主體細胞，在外界刺激下可通過向不同方向極化來分泌不同細胞因子，對局部組織的炎癥反應發揮調控作用［2］。近年來，巨噬細胞在骨結合形成中的作用越來越受到重視。研究表明，當種植體植入體內后，巨噬細胞首先發生反應，且其極化方向對于生物材料的預后具有顯著影響。巨噬細胞的極化可分為M1 和M2 兩大類，在種植體植入早期為手術創傷造成的無菌性炎癥反應，巨噬細胞向M1 方向極化分泌炎性因子，及時清理局部壞死組織碎片；隨著時間推移，巨噬細胞向M2 方向極化，分泌促進組織愈合的生長因子，促進種植體建立骨結合［3］。因此，誘導巨噬細胞M2 方向極化目前已經成為促進種植體骨結合的新策略［4］。

已有研究證實多種刺激均可誘導巨噬細胞向M2 極化，主要包括材料表面的物理形貌刺激［5］、化學基團誘導［6］以及細胞因子刺激［7］等，其中姜黃素（curcumin，CUR）是最為經典的誘導M2 極化的小分子藥物之一，其作用的機理主要是通過激活巨噬細胞內過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxi?some proliferator?activated receptor γ，PPARγ）誘導M2 極化發生［8］，被廣泛應用于抗炎治療中，是極具治療前景的小分子藥物。另一方面，有研究證實miRNA?130a?3p 為PPARγ內源性抑制分子，采用其反義寡核苷酸（anti?sense oligonucleotides，ASO）轉染巨噬細胞后可解除miRNA?130a?3p 對PPARγ的抑制作用，從而促進巨噬細胞M2 極化［9］。因此，筆者推測將ASO 與CUR 共遞送至巨噬細胞內，利用ASO 解除miRNA?130a?3p 對PPARγ的抑制，有利于CUR 與PPARγ受體的結合，高效地誘導巨噬細胞M2 型極化。共遞送系統是在一種載體上同時負載兩種具有協同作用的藥物分子，同時遞送至靶細胞后二者可發揮協同作用，進一步增強藥物的治療作用［10］。

基于以上分析，本研究擬采用廣泛使用的介孔硅納米粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）構建共遞送系統，利用MSN 內部的規則孔道吸附小分子CUR，在外層利用聚乙烯亞胺（polyethyleni?mine，PEI）吸附siRNA/miRNA 分子［11］，分析其對巨噬細胞的作用，為高效誘導巨噬細胞向M2 極化提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料 十六烷基三甲基溴化銨（cetyltri?methylammonium bromide，CTAB）、氫氧化鈉（sodi?um hydroxide，NaOH）、正硅酸四乙酯（tetraethyl or?thosilicate，TEOS）、PEI（Sigma?Aldrich，美 國）；RAW264.7 小鼠巨噬細胞系（ATCC，美國）；DMEM培養基、胎牛血清、青?鏈霉素、PBS 緩沖液、胰蛋白酶等細胞培養試劑（Hyclone，美國）；MTT、DAPI、CUR、DiI（MP Biomedical，美國）；總RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、引物以及實時定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本）；抗體（ABCAM，英國）；靶向GAP?DH 的siRNA（siGAPDH，正義：5'?CACUCAAGAUU?GUCAGCAATT?3'；反義：5'?UUGCUGACAAUCUUG?AGUGAG?3'）、siRNA 陰性對照（siNC，正義：5'?UU?CUCCGAACGUGUCACGUTT?3'；反義：5'?ACGUG?ACACGUUCGGAGAATT?3'）、miRNA 錯 配 序 列 陰性 對 照（miNC，5'?CGGUACGAUCGCGGCGGGAU?AUC?3'）、miR?130a?3p 反義寡核苷酸（ASO，5'?AUGCCCUUUAACAUUGCACUG?3'）等購于上海吉瑪公司。

1.2 MSN 的合成及共遞送系統構建

依據文獻報道［12］，采用常規sol?gel 方法制備MSN，即稱取0.50 g CTAB 溶解于250 mL 去離子水中，加入1.75 mL 2.0 mol/L NaOH 溶液，充分攪拌并升溫至80 ℃，反應30 min，然后在劇烈攪拌下加入2.75 mL TEOS，至產生白色沉淀后加入2.50 mL 乙酸乙酯，80 ℃反應2 h。室溫陳化過夜后，離心，用超純水和無水乙醇各洗滌3 次，抽濾，真空干燥，得到白色固體。將白色固體轉入三口燒瓶中，加入50 mL 無水乙醇，2.5 mL 鹽酸充分分散后，80 ℃加熱回流24 h 去除CTAB，用超純水和無水乙醇各洗滌3 次，抽濾。真空干燥，得到MSN。

1.3 CUR 與siRNA 的共遞送系統構建

采用MSN 構建CUR 與質粒的共遞送系統進行本實驗［13］。取上述MSN 粉末4 mg 加入到1 mL 含有1 mg CUR 的無水乙醇溶液中，使藥物與載體的質量比分別為1∶4，超聲至MSN 完全分散后，磁力攪拌過夜，將溶液于15 000 rpm/min 離心15 min，沉淀經無水乙醇洗滌3 次，真空干燥，得到淡黃色顆粒CUR@MSN。稱取1 mg PEI 加入到1 mL 無水乙醇中超聲分散，將CUR@MSN 加到PEI 溶液中，水浴超聲30 min，離心，無水乙醇洗滌3 次，得到（CUR@MSN）PEI。將（CUR@MSN）PEI 顆粒加入到siRNA（2 μmol/L）溶液中，水浴超聲30 min，離心，無水乙醇洗滌3 次，得到（CUR@MSN）PEI/siRNA 納米共遞送系統。將樣品分散在無水乙醇中，滴在銅網上，在室溫下干燥數小時后行透射電鏡觀察。

將適當稀釋后的CUR@MSN 吸取1 mL 轉入透析袋內（截留相對分子質量為3 500），密封后放入200 mL 含0.2% SDS 的PBS 溶液中，于37 ℃恒溫水浴；分別于2、4、6、12、24、48、72 h 后取透析液1 mL，同時補充等量的釋放介質；通過在酶標儀A425nm處測定吸光度的方法測定CUR 含量，并計算累積釋放百分比。

1.4 細胞培養及活力檢測

采用巨噬細胞株RAW264.7 細胞進行后期細胞實驗，細胞培養液為DMEM+10%胎牛血清+1%青?鏈霉素，在37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，在細胞密度為80%左右時進行胰蛋白酶消化傳代。將細胞接種在96 孔板內，將（CUR@MSN）PEI 納米粒用培養基倍比稀釋后處理細胞24 h，隨后換成普通培養基再培養24 h 后進行MTT 法檢測細胞活力。具體方法：將5 mg/mL 的MTT 溶液與培養液預混合（MTT：培養液=1∶4）后加入細胞培養孔內，每孔200 μL，在細胞培養箱孵育4 h 后取出，酶標儀A580nm測吸光度值，并用未處理細胞進行數據標準化。

1.5 細胞轉染效果觀察

將RAW264.7 細胞接種在玻底培養皿內，使用FAM 熒光標記的siRNA 進行細胞轉染實驗，在轉染結束后與含DiI 染料的培養基孵育15 min，吸棄培養液后使用4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS清洗兩遍，DAPI 染色液染色5 min，PBS 清洗兩遍后，使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細胞轉染效果。

另一方面，在轉染結束后立刻采用胰蛋白酶消化，離心收集細胞團塊，采用2.5%戊二醛與4%多聚甲醛混合液（1∶1）進行固定后采用1%鋨酸進行二次固定，酒精梯度脫水后環氧樹脂包埋、鉆石刀超薄切片，銅網撈片后行醋酸鈾/檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察納米粒在細胞內的分布情況。

1.6 實時定量PCR（RT?qPCR）檢測GAPDH 的沉默效率

將RAW264.7 細胞接種在6 孔板內，按照轉染復合物的不同分成4 組，即實驗組：CUR?siGAPDH共遞送體系［（CUR@MSN）PEI/siGAPDH］；對照組：未處理細胞（未進行轉染）、空白載體［（CUR@MSN）PEI］、CUR?siNC 共遞送體系［（CUR@MSN）PEI/siNC］。將各組轉染復合物加入細胞培養液中，十字混勻；轉染4 h 后更換為普通培養基繼續培養；在48 h 后，采用RNA 提取試劑盒提取細胞內總RNA，采用PrimerScript RT reagent Kit 試劑盒逆轉錄合成cDNA，再以cDNA 為模板使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒進行RT?qPCR 反應，以β?actin 作為內參基因，檢測GAPDH 的沉默效率。其中，小鼠GAPDH 引物序列為：上游引物5'?GTTGTCTCCTGC?GACTTCA?3'，下游引物5'?GGTGGTCCAGGGTTTC?TTA?3’'；小鼠β?actin 引物序列為：上游引物5'?CT?GTCCCTGTATGCCTCTG?3'，下游引物5'?ATGTCA?CGCACGATTTCC?3'。

1.7 CUR?ASO 共遞送體系對巨噬細胞M2 型極化的影響

將RAW264.7 細胞接種在6 孔板內，按照轉染復合物的不同分成4 組，即實驗組：CUR?ASO 共遞送體系［（CUR@MSN）PEI/ASO］，其中ASO 為miR?130a?3p 反義寡核苷酸；對照組：未處理組（未進行轉染）、空白載體［（CUR@MSN）PEI］、CUR?miNC 共遞送體系［（CUR@MSN）PEI/miNC］。轉染4 小時后更換為普通培養基繼續培養，在3 d 后采用West?ern Blot 進行Arg?1 蛋白的表達檢測。主要步驟為采用RIPA 加蛋白酶抑制劑裂解細胞，提取總蛋白，煮沸10 min 后與上樣緩沖液混合進行SDS?PAGE 凝膠電泳，轉膜后與Arg?1、β?actin 的一抗孵育過夜，次日與HRP 偶連的二抗孵育后發光液成像。采用ImageJ 分析條帶灰度值。

1.8 統計學分析

用Graphpad Prism 8 軟件處理數據，計量數據采用均數± 標準差表示，不同組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK?q 檢驗，校驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 納米粒表征觀察

采用透射電鏡觀察可見制備的MSN內部呈現出經典的孔道結構，整體納米粒直徑80～100 nm（圖1a）；在吸附CUR 小分子后，MSN 內部的孔道結構被低電子密度物填充，提示CUR 成功吸附進入MSN 內部（圖1b）；在CUR@MSN 表面吸附PEI 大分子后，納米粒的直徑有所增大，內部孔道結構仍被低電子密度物充填，表明CUR@MSN 表面形成了PEI 涂層，且MSN 內部的CUR 未發生泄漏（圖1c）。通過紫外分光光度計檢測，可計算出MSN 對CUR 的包封率和載藥率分別為65.74%、16.57%，加載siRNA 的效率約94%。通過累積釋放曲線可見，CUR 被MSN 吸附進入內部后呈現出緩慢釋放的特征，在最初24 h 內可累積釋放約20%，隨后的釋放量較小（圖1d），表明MSN 可實現CUR 的長期攜帶作用。

Figure 1 Transmission electron microscopy observation during the preparation of nanoparticles and release curve after the adsorption of CUR圖1 納米粒制備過程的透射電鏡觀察及吸附CUR 后的釋放曲線

2.2 細胞毒性篩查

分別采用不同濃度的（CUR@MSN）PEI 納米粒處理細胞，采用MTT 法檢測細胞活力以評估對細胞安全的濃度范圍。可見在高濃度的納米粒處理下，細胞活力受到顯著抑制，當粒子濃度低于10 μg/mL 時細胞活力在90%以上，未表現出明顯的細胞活力抑制（圖2），提示該濃度為安全范圍，在后期細胞功能實驗中均采用了10 μg/mL 進行轉染。

2.3 細胞轉染觀察

共聚焦顯微鏡觀察可見綠色熒光聚集在紅色區域內、藍色細胞核周圍（圖3a），表明納米粒可被細胞攝取；同時，透射電鏡可直接觀察到細胞內的（CUR@MSN）PEI/siRNA 納米顆粒聚集（圖3b），放大觀察后可見納米粒已部分發生降解（圖3c）。以上結果表明納米共遞送系統可成功轉染進入巨噬細胞，且轉染效率較高。

Figure 3 (CUR@MSN)PEI/siRNA nanoparticle uptake observed by confocal microscopy and TEM圖3 共聚焦顯微鏡和透射電鏡觀察細胞攝取（CUR@MSN）PEI/siRNA 納米粒

2.4 靶基因沉默效率檢測

采用RT?qPCR 檢測GAPDH 的表達變化，在導入GAPDH 的siRNA 后細胞表達GAPDH 下降到未轉染細胞的0.16 倍，即沉默效率高達80%以上（圖4，P ＜0.01）；陰性對照siRNA 則未表現出顯著的沉默效果，表明沉默作用是來自于siRNA 的序列匹配作用。這表明（CUR@MSN）PEI 載體系統可安全高效的遞送siRNA/miRNA，進而達到沉默靶基因的目的。

2.5 巨噬細胞M2 極化檢測

與未處理的細胞組相比，（CUR@MSN）PEI 和（CUR@MSN）PEI/miNC 組的Arg?1 表達提升2～3 倍（P ＜0.05），（CUR@MSN）PEI/ASO 組的Arg?1 表達提升約8 倍（P ＜0.05）（圖5）。

Figure 5 Arg?1 protein expression in macrophages after the co?delivery of CUR?ASO圖5 CUR?ASO 共遞送系統轉染巨噬細胞后Arg?1 蛋白的表達

3 討 論

3.1 基于MSN 的共遞送系統制備與表征

種植體在植入體內后巨噬細胞首先發生反應調控無菌性炎癥反應，其不同的極化方向對于炎癥轉歸至關重要，其中M2 方向極化的巨噬細胞可分泌白介素?4（interleukin?4，IL?4）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等細胞因子，促進局部組織的愈合過程，有利于骨結合的快速建立。因此通過調控種植體周圍巨噬細胞向M2 方向極化促進其與機體的整合效果已經成為了新的策略。CUR 是較為經典的誘導M2 極化的小分子藥物，為更好發揮CUR 作用，本研究制備出基于MSN 的CUR 與siRNA 的共遞送系統，通過透射電鏡觀察證實了合成的MSN 呈現經典的規整孔道結構，內部和表面分別成功吸附了小分子CUR 和高分子PEI。由于MSN 的特殊結構，其內部孔道可用于吸附分子量較小的分子，表面可吸附分子量較大的分子，是共遞送載體的理想選擇［11］。

多種納米載體系統均可用于共遞送系統的構建，除了常用的MSN，還包括有機陽離子聚合物等［14］，這種共遞送系統能夠克服單一藥物的不足，發揮兩種藥物優勢的協同作用。例如針對腫瘤耐藥問題，其機理為耐藥腫瘤細胞內高表達P?glyco?protein（Pgp）分子，有研究采用介孔硅內部負載抗腫瘤藥物多柔比星，表面攜帶針對Pgp 的siRNA，在進入細胞后可沉默細胞Pgp 分子的表達，從而解除細胞對多柔比星的耐藥性［15］。

3.2 納米粒的毒性及細胞攝取

在成功構建出納米遞送系統后，納米材料的細胞毒性是進行生物應用首先考慮的問題。與文獻報道類似［16］，本研究制備的負載CUR 和PEI 修飾后的MSN 表現出劑量依賴性的細胞毒性反應，在合適的濃度范圍內納米粒對細胞活力的影響可以被控制在理想范圍，實現細胞內的藥物遞送作用。在安全的濃度范圍內處理細胞，通過激光共聚焦顯微鏡可觀察到細胞攝取了siRNA 進入胞漿，進一步采用透射電鏡可直接在胞漿內觀察到納米粒聚集存在；此外，在透射電鏡觀察中可見納米粒聚集性存在于囊泡結構中，表明細胞是通過內吞作用進行納米粒攝取，這與前期報道的MSN 進入細胞的途徑一致［17］；部分納米粒的結構變得模糊，表明在被細胞攝取后逐漸發生了降解，MSN 的這種快速降解特性也為其生物安全性提供了保證［18］。

3.3 靶基因沉默效率及誘導巨噬細胞M2 極化

采用陽性對照GAPDH siRNA 進行細胞轉染是評估轉染載體常用的方法，可避免靶基因的差異性對載體的轉染效率產生影響，能夠更好地確定轉染載體的作用效率［19］。本實驗構建的（CUR@MSN）PEI 納米載體可高效實現RAW264.7的GAPDH 沉默，為負載功能性的核酸奠定了基礎。

在誘導實驗中，單純導入CUR 即可誘導巨噬細胞M2 極化標志物Arg?1 的高表達，證實了CUR可通過激活PPARγ 受體誘導巨噬細胞的M2 極化。Arg?1 是最為常用的巨噬細胞M2 極化的標志分子，本課題組前期研究也以該分子的變化作為衡量巨噬細胞M2 極化程度的關鍵指標，是較為簡便、可靠的方法［20］。Su 等［9］采用高通量組學的方法系統性探索了巨噬細胞極化過程中miRNA 的調控網絡，發現miRNA?130a?3p 在巨噬細胞M2 極化中表達下調，進一步分析發現其靶基因恰為PPARγ受體，即當巨噬細胞向M2 方向極化時miR?NA?130a?3p 發揮內源性抑制PPARγ受體的作用，當引入miRNA?130a?3p 的反義序列ASO 后，可解除其抑制效應，進一步提升巨噬細胞M2 向極化。本研究中也發現，相比單純CUR 的處理組，同時轉染ASO 后可顯著進一步誘導巨噬細胞M2 極化標志物Arg?1 的表達，表明ASO 與CUR 可能發生了協同作用，共同提升了巨噬細胞向M2 極化。

綜上所述，本研究成功構建了基于MSN 的CUR 與siRNA/miRNA 的共遞送系統，在安全濃度范圍內可高效轉染巨噬細胞，發揮小分子藥物與核酸的協同作用，高效誘導巨噬細胞M2 向極化。這為誘導種植體周圍巨噬細胞的M2 向極化，促進骨結合的建立提供了新策略。

【Author contributions】Li PH wrote the article. Lang K analyzed the data. Song W designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.