口腔白斑病組織中環(huán)狀RNA 的差異表達(dá)譜分析

徐思明， 宋雨翰， 邵彥雄， 陶嵐， 周海文

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔黏膜病科，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海（200011）； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔綜合科，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海（200011）

口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）是一種發(fā)生在口腔黏膜上以白色為主、不能擦除的斑片或斑塊，臨床或病理上不能診斷為其他任何疾病的口腔黏膜潛在惡性疾病。流行病學(xué)顯示OLK 的惡性轉(zhuǎn)化率高達(dá)3%～18%，非均質(zhì)的OLK 惡性轉(zhuǎn)化率甚至高達(dá)15%～40%［1］。OLK 的病因較為復(fù)雜，發(fā)病機(jī)理仍不清楚，目前臨床上沒(méi)有特效治療方法，因此研究OLK 發(fā)病機(jī)制并確定新的潛在分子標(biāo)志物具有重要意義。環(huán)狀RNA（circRNA）是具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA［2］。有報(bào)道表明circRNA 在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管疾病、炎癥及免疫疾病中發(fā)揮重要的作用［3?7］。研究表明circRNA可作為有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［8?11］。但目前還沒(méi)有OLK 相關(guān)circRNA 的報(bào)道。本研究通過(guò)高通量測(cè)序描繪OLK 和正常口腔黏膜（normal oral mucosal，NOM）組織中circRNA 的表達(dá)譜，并通過(guò)對(duì)篩選出的顯著差異表達(dá)的circRNA 進(jìn)行驗(yàn)證分析，同時(shí)構(gòu)建circRNA?miRNA?mRNA 的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）網(wǎng)絡(luò)，為circRNA 在OLK 發(fā)病機(jī)制中的機(jī)理研究提供新的研究方向。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018 年9 月至11 月于上海第九人民醫(yī)院口腔黏膜科接受治療的OLK 患者的白斑組織26例，男女比例1∶1。患者的組織樣本都通過(guò)組織病理學(xué)檢查確診為OLK。26 例NOM 組織來(lái)自整復(fù)外科及口腔外科拔牙的手術(shù)患者。組織納入標(biāo)準(zhǔn)為不伴有系統(tǒng)性疾病，且3 個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)免疫刺激治療（包括類固醇治療），無(wú)放療、化療史。所有的組織樣本取樣后都立即放入液氮保存。提供組織樣本的患者均于術(shù)前簽署知情同意書(shū)，本研究已通過(guò)上海第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批［審批編號(hào)：（2012）21］。從收集的52 例樣本中選取6 例OLK 組織及6 例NOM 組織進(jìn)行高通量測(cè)序，樣本信息見(jiàn)表1，并采用qRT?PCR 驗(yàn)證這52 例組織中篩選重點(diǎn)circRNA 的表達(dá)情況。

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol 裂解液（Life Technologies，美國(guó)）；Ribo?Zero rRNA Removal Kits（Illumina，美國(guó)）；TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit（Illumina，美國(guó)）；SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）；qRT?PCR 引物（上海云序生物工程技術(shù)有限公司）；qPCR SYBR Green master mix（上海云序生物科技有限公司）；RNaseR（epicentre，美國(guó)）；RNase inhibitor（Millipore，美國(guó)）。NanoDrop ND?1000 儀器（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；BioAnalyzer 2100 儀器（Agilent Technologies，美國(guó)）；Illumina HiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)（上海云序生物科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher，美國(guó)）；Gene Amp PCR Sys?tem 9700（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó)）。

表1 高通量測(cè)序口腔白斑組織的臨床特點(diǎn)Table 1 The clinical characteristics of patients with oral leukoplakia for sequencing

1.3 RNA 提取及質(zhì)控

使用TRIzol 試劑盒提取總RNA，使用NanoDrop ND?1000 儀測(cè)量每個(gè)樣品的RNA 濃度。以吸光光度（OD）260/280值作為RNA 純度指標(biāo)。使用Ribo?Zero rRNA Removal Kits 移除總RNA 中的rRNA。采用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit 預(yù)處理RNA，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。采用BioAnalyzer 2100 儀器進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)控和定量。根據(jù)Illumina 測(cè)序說(shuō)明，將10 pM 文庫(kù)變性為單鏈DNA 分子，在Illumina flowcell上捕獲，原位擴(kuò)增為簇，并在Illumina HiSeq 測(cè)序儀上采用雙端模式（PE mode）進(jìn)行150 cycle 測(cè)序。

1.4 circRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Illumina HiSeq 4000 測(cè)序儀測(cè)序，并使用circBase 數(shù)據(jù)庫(kù)和circ2Traits 對(duì)所鑒定的環(huán)狀RNA進(jìn)行注釋［12?13］。參考倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）和P 值進(jìn)行篩選，選擇FC ≥2.0，P ＜0.05 作為篩選差異circRNA 的閾值。circRNA 高通量測(cè)序由上海云序生物有限公司完成檢測(cè)及數(shù)據(jù)初步分析。

1.5 qRT?PCR、酶耐受及sanger 測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，選取表達(dá)差異程度較顯著的circRNA（FC 越大，P 值越小越佳；原始信號(hào)表達(dá)值越平均越佳），并結(jié)合功能分析結(jié)果，共選取10 個(gè)circRNA，采用測(cè)序的6 對(duì)樣本進(jìn)行qRT?PCR 驗(yàn)證。對(duì)提取的RNA 使用SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 文庫(kù)。選取GAPDH 為內(nèi)參，使用ViiA 7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，采用qPCR SYBR Green master mix 試劑盒進(jìn)行qRT?PCR。本研究所用引物序列由上海生工提供，引物序列見(jiàn)表2。采用2?ΔΔCt法對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算分析，得到各目的基因差異表達(dá)情況。根據(jù)PCR 選取circRNA 進(jìn)行酶耐受實(shí)驗(yàn)，使用RNase處理提取的RNA，37 ℃水浴20 min，結(jié)果合格者進(jìn)行sanger 測(cè)序驗(yàn)證。另選OLK 與NOM 的樣本組織各20 例，對(duì)篩選合格circRNA circHLA?C 進(jìn)行qRT?PCR 進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 qRT?PCR 引物信息Table 2 The primers used for qRT?PCR experiments

1.6 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及功能富集分析

通過(guò)TargetScan 和miRanda 預(yù)測(cè)目的circRNA下游的miRNA、mRNA，利用生物信息學(xué)軟件Cyto?scape（v2.8.0）構(gòu)建ceRNA 網(wǎng)絡(luò)圖。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 功能通路分析，預(yù)測(cè)差異circRNA 的功能和參與的功能通路。GO 分析主要?dú)w類為三部分，包括：生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能。GO 分析是根據(jù)差異表達(dá)circRNA 的來(lái)源基因和GO 注釋列表對(duì)GO條目進(jìn)行篩選。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 和Graphpad Prism 8.0完成。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用±s 表示，兩組間比較采用獨(dú)立t 檢驗(yàn)。使用ROC 曲線分析circH?LA?C 診斷的特異性與靈敏性，并用spearman 等級(jí)相關(guān)分析circHLA?C 與OLK 異常增生程度相關(guān)性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OLK 與NOM 間差異circRNA 表達(dá)譜及表達(dá)特點(diǎn)

聚類分析圖顯示了OLK 與NOM 間的差異cir?cRNA 表達(dá)譜（圖1a）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，繪制散點(diǎn)圖和火山圖（圖1b、1c）。在OLK 中，共鑒定出366 個(gè)顯著差異的circRNA，其中65 個(gè)上調(diào)，301 個(gè)為下調(diào)。在這366 個(gè)circRNA 中，發(fā)現(xiàn)28 個(gè)新的cir?cRNA，其余的circRNA 在circbase 中已有過(guò)報(bào)道，且差異表達(dá)circRNA 大多數(shù)為外顯子circRNA（圖2a、2b），提示差異circRNA 具有重要的生物學(xué)功能。circRNA 的長(zhǎng)度集中在小于500 bp 和500～2 000 bp 兩組內(nèi)（圖2c）。這些差異表達(dá)circRNA 幾乎分布在所有染色體上，包括22 條常染色體和X染色體（圖2d），提示差異circRNA 分布較為廣泛。

Figure 1 Expression profiles of circRNAs in OLK versus NOM tissues圖1 OLK 與NOM 組織中circRNA 的表達(dá)譜

未經(jīng)處理和分析的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后，已上傳至GEO 網(wǎng)站，GEO 序列號(hào)為GSE131568。

2.2 進(jìn)一步驗(yàn)證目的circRNA

選取的10 個(gè)circRNA 包括4 個(gè)表達(dá)上調(diào)和6 個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNA（表3）。經(jīng)驗(yàn)證，在這10 個(gè)circRNA 中有7 個(gè)qRT?PCR 結(jié)果與測(cè)序結(jié)果保持一致，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05，圖3）。由于cir?cRNA 對(duì)核酸酶不敏感，通過(guò)qRT?PCR 驗(yàn)證的7 個(gè)circRNA 中選擇了5 個(gè)疾病相關(guān)性高的circRNA 進(jìn)行酶耐受實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表示，circHLA?C、circPLIN4（perilip3?4）和circRNF13 可抵抗核糖核酸酶的水解（圖3c），對(duì)這3 個(gè)circRNA 進(jìn)行Sanger 測(cè)序。結(jié)果顯示，差異表達(dá)最顯著的circHLA?C 是真正的circRNA，且具有特定反式剪接位點(diǎn)。進(jìn)一步對(duì)circHLA?C 進(jìn)行了可視化分析，circHLA?C 由8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子組成，且反剪接位點(diǎn)為CTACCT?GG（圖4）。

Figure 2 Distribution of the characteristics of significantly dysregulated circRNAs圖2 顯著表達(dá)差異circRNA 分布特點(diǎn)

表3 OLK 組織10 個(gè)顯著表達(dá)差異circRNATable 3 Ten circRNAs differentially expressed in OLK

Figure 3 Ten circRNAs differentially expressed in OLK圖3 OLK 組織10 個(gè)顯著差異表達(dá)circRNA

2.3 OLK 中circRNA 的 功 能 富 集

在OLK 表達(dá)上調(diào)的circRNA 中，circHLA?C 的來(lái)源基因HLA?C 富集到多達(dá)95 個(gè)GO 功能條目，分別包括44 條生物學(xué)過(guò)程、45 條細(xì)胞組分和6 條分子功能通路（見(jiàn)本文OSID 碼）。HLA?C 在生物學(xué)過(guò)程中可參與調(diào)控T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和免疫功能。在細(xì)胞組分功能富集分析中，發(fā)現(xiàn)HLA?C可調(diào)控Ⅰ類人類主要組織相容復(fù)合體（major histo?compatibility complex，MHC）。

通過(guò)來(lái)源基因的相關(guān)通路，進(jìn)行KEGG 通路富集分析，預(yù)測(cè)circRNA 功能通路。與366 個(gè)差異基因相關(guān)的KEGG 通路共有139 條，其中富集到上調(diào)的circRNA 通路有60 條。OLK 作為一種癌前病變，在上調(diào)通路中共預(yù)測(cè)到3 條KEGG 通路參與癌變過(guò)程。腫瘤相關(guān)蛋白聚糖、腫瘤相關(guān)miRNA 和腫瘤相關(guān)通路都可參與調(diào)節(jié)胞外信號(hào)蛋白激酶/促分裂原活化蛋白激酶（extracellular?signal?regulated protein kinase/mitogen?activated protein kinase，ERK/MAPK1），二者已被證明是OLK 發(fā)病的關(guān)鍵因素［14?15］。301 個(gè)下調(diào)circRNA 參與的79 條KEGG 通路，其中顯著調(diào)節(jié)的有泛素介導(dǎo)的蛋白水解、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路（圖5）。

2.4 ROC曲線分析circHLA?C對(duì)OLK的診斷意義

通過(guò)ROC 曲線分析評(píng)估circHLA?C 對(duì)OLK 的診斷意義。circHLA?C 曲線下面積（Area Under Curve，AUC）為0.955（95% CI：0.892～1.00，P＜0.001）（圖6）。提示circHLA?C 具有成為OLK 生物標(biāo)志物的可能性。

2.5 circHLA?C 與OLK 異常增生的相關(guān)性

Figure 4 Ring formation mechanism and back spliced site of circHLA?C圖4 circHLA?C 的成環(huán)機(jī)制及反剪接位點(diǎn)

分析20例OLK組織circHLA?C的表達(dá)量與異常增生程度的相關(guān)性，結(jié)果表明circHLA?C 表達(dá)量與OLK輕、中度異常增生呈正相關(guān)（r＝0.478，P＝0.033）。

2.6 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)分析

本研究共篩選出7 個(gè)circRNA 建立ceRNA 網(wǎng)絡(luò)（圖7）。根據(jù)結(jié)合能力，列出了每個(gè)circRNA 調(diào)控的前5 個(gè)miRNA。生物信息學(xué)繼續(xù)分析下游的miRNA?mRNA 網(wǎng)絡(luò)，圖中呈現(xiàn)了前5 個(gè)miRNA 能在下游抑制的mRNA。這表明circRNA 具有十分廣泛的作用空間，可通過(guò)多種不同的通路對(duì)下游分子甚至是蛋白進(jìn)行調(diào)控。

Figure 6 ROC curve analysis of circHLA?C in OLK圖6 circHLA?C 在OLK 中的ROC 曲線分析

3 討 論

OLK 是最常見(jiàn)的口腔黏膜潛在惡性病變，研究表明OLK 發(fā)生癌變平均需要4 至5 年［16?17］，因此，OLK 的早期診斷和治療非常重要。circRNA 曾被認(rèn)為是分子內(nèi)錯(cuò)剪接的副產(chǎn)物［18］。近年來(lái)，cir?cRNA 得到越來(lái)越多科研界研究者的關(guān)注，目前circRNA 已在真核細(xì)胞內(nèi)確認(rèn)是一類新的廣泛存在、豐度高、保守性高且較為穩(wěn)定的內(nèi)源性非編碼RNA［19?21］。研究表明circRNA_100290，circDOCK1和circ_0007059 可通過(guò)ceRNA 機(jī)制調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous carcinoma cell，OSCC）的生長(zhǎng)和 轉(zhuǎn) 移［22?24］。hsa_circ_0005320，hsa_circ_0067531和hsa_circ_0000869 可調(diào)控口腔黑色素瘤的形成和轉(zhuǎn)移［25］。

circRNA 可作為順式作用元件調(diào)控其親本基因的表達(dá)，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄［26］。本研究通過(guò)circRNA來(lái)源基因的功能預(yù)測(cè)circRNA 的功能。HLA?C 表達(dá)的變化可影響免疫系統(tǒng)對(duì)感染性和自身免疫性疾病的應(yīng)答效果，且HLA?C 的進(jìn)化使其與殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體的相互作用更加強(qiáng)烈，從而影響自然殺傷細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)［27］。研究表明KIR2DL1（+）?HLA?C2（+）基因型可能是OSCC 早期易感人群的危險(xiǎn)因素［28］。

GO 功能富集分析顯示差異表達(dá)circRNA 具有豐富的功能，多數(shù)差異表達(dá)circRNA 都可富集到細(xì)胞周期過(guò)程。推測(cè)調(diào)控細(xì)胞周期的基因表達(dá)的變化是OLK 發(fā)生的主要原因之一。HLA?C 可富集到功能T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和免疫、MHCⅠ類蛋白復(fù)合體。研究表明，MHCⅠ類分子與特異性T 細(xì)胞受體和CD8+細(xì)胞表面分子的識(shí)別有關(guān)。MHCⅠ類分子是OLK 中的關(guān)鍵分子，在OLK 中呈低表達(dá)，且與異常增生程度相關(guān)［29?30］。此外，OSCC 和伴異常增生OLK 中CD8+細(xì)胞數(shù)量明顯多于無(wú)異常增生的OLK［31］。

KEGG 通路富集分析顯示在60 種上調(diào)的cir?cRNA 通路中，富集分?jǐn)?shù)排名前10 通路包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、EB病毒感染、蛋白多糖在癌癥中的作用、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路和移植物排斥等。在這些途徑中，circH?LA?C 的靶基因參與了自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、EB 病毒感染和移植物排斥。這一結(jié)果提示OLK 可能與感染和免疫抑制因子有關(guān)，而circHLA?C 可能是其中的關(guān)鍵因素。與NOM 組織樣本相比OLK 中circHLA?C 顯著升高。ROC 曲線表明circH?LA?C 對(duì)OLK 的診斷具有較高的特異性和靈敏性，且circHLA?C 的表達(dá)量與輕、中度異常增生程度呈正相關(guān)。揭示了circHLA?C 可能成為新的生物標(biāo)志物。

研究表明circRNA 可作為ceRNA 作用于細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［32］。本研究構(gòu)建的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)顯示circHLA?C 可通過(guò)海綿機(jī)制與miR?9、miR?339?5p、miR?29a?3p、miR?26a?5p、miR?222?3p 進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，通過(guò)TargetScan、MiRanda 軟件可預(yù)測(cè)circHLA?C 與以上miRNA 之間具有結(jié)合位點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)OLK 和OSCC 患者血清miR?9 表達(dá)較NOM 標(biāo)本明顯降低［33］。在OLK 和一些原發(fā)癌組織中，miR?339?5p 表達(dá)下調(diào)，作為腫瘤抑制因子參與癌癥進(jìn)展［34?35］。miR?29a?3p 和miR?26a?5p 在OLK 和癌組織中顯著下調(diào)［36］。此外，與正常和OSCC 患者相比，OLK 中miR?222?3p 顯著下調(diào)［37］。由此可見(jiàn)，circHLA?C 可能具有同一miRNA 的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)或多個(gè)不同miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)。circHLA?C 可能就是通過(guò)海綿吸附這些miRNAs 來(lái)調(diào)控OLK 的發(fā)生發(fā)展。對(duì)于circHLA?C 與miRNAs 及OLK 下游靶基因的相互作用，今后還需要進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，本研究探討了circRNA 在OLK 病因病理及發(fā)生發(fā)展中的作用，并揭示了circHLA?C 具有成為OLK 潛在分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的可能。

【Author contributions】Xu SM wrote and revised the article. Song YH, Shao YH, Tao L directed the data collection and analysis. Zhou HW designed the study. All authors read and approved the final manu?script as submitted.