基于網絡藥理學探討金葉拜毒顆粒抗新冠病毒的作用機制

彭雙鳳 田 鑫 王 興 廖金花 徐麗麗 李 林*

1.江西中醫藥大學,江西 南昌 330006;2.江西中醫藥大學附屬醫院,江西 南昌 330006

2019年12月份以來，新型冠狀病毒迅速蔓延，輕度患者出現發熱、乏力、干咳等癥狀，嚴重者可出現呼吸困難、急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙等[1]。

在本次抗新型冠狀病毒肺炎的過程中，同濟醫院醫護人員相繼選用金葉拜毒顆粒作為新型冠狀病毒肺炎的預防方，并取得較佳的防治療效。因此金葉拜毒顆粒被作為一般患者隔離期的推薦用藥，被載入《同濟醫院關于新型冠狀病毒感染的肺炎中醫診療方案及預防方案》，并得到了湖北省衛健委的肯定，金葉敗毒顆粒也被列入新冠肺炎的防控藥品之一[2]。

故本文運用網絡藥理學，分析金葉拜毒顆粒中藥物化學成分的作用靶點及相關通路，預測金葉拜毒顆粒治療新型冠狀病毒肺炎的潛在機制，為中醫藥治療新型冠狀病毒肺炎提供一定的理論基礎與科學依據。

1 材料與方法及結果

1.1 篩選金葉拜毒顆粒潛在活性化合物 在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫中設定口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，以金葉拜毒顆粒組成藥物：金銀花、大青葉、魚腥草為關鍵詞進行篩選，篩選后得到每味藥材的有效成分。檢索已報道的相關文獻[3-6]，收集蒲公英的有效成分和化合物。得到金葉拜毒顆粒主要活性化合物共23個，其中金銀花14個，大青葉6個，魚腥草2個，根據文獻報道蒲公英收集其主要化合物6個。

1.2 篩選金葉拜毒顆粒作用靶點 基于TCMSP數據庫，根據上述篩選出的金銀花、大青葉、魚腥草3味有效成分預測作用靶點。根據相關文獻得到蒲公英的主要化合物，在PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)搜索其化合物名稱得到CAS號，下載其分子結構圖，前往Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetp rediction.ch/)進行蒲公英靶點預測。得到作用靶點：金銀花449個，大青葉83個，魚腥草195個，蒲公英600個，去重后，共得到藥物靶點465個。

1.3 獲取疾病靶點 基于GeneCard(https://www.genecards.org)、OMIM(https://omim.org)和“Corona Virus Disease 2019、CoronaVirus”為關鍵詞，選擇物種為Homosapiens，檢索得到COVID-19相關靶點465個。

1.4 潛在作用靶點的獲取 利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數據庫查詢金葉拜毒顆粒可能的作用靶點蛋白對應的基因名，規范靶點蛋白。在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)分別錄入金葉拜毒顆粒和新型冠狀病毒肺炎靶點基因，繪制韋恩圖(圖1)，兩者取交集后獲得共同靶點71個。

1.5 金葉拜毒顆粒化學成分-靶點網絡的建立 將藥物的化學成分，以及“1.4”所得的潛在作用靶點分別導入Cytoscape3.7.2軟件，使用Network Analyzer 功能對藥物中的主要化學成分進行分析，構建“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網絡(圖2)，其中金葉拜毒顆粒中有23個有效成分對新型冠狀肺炎具有調節作用。根據節點度值(Degree)等網絡拓撲學特征進行核心節點的篩選，Degree表示預測出該成分與作用靶點的關聯個數，成分的Degree值越大說明該成分越重要，在與潛在靶點相互作用的化學成分中，Degree>8(2倍中位數)的化學成分有9種，Degree值從大到小分別為：槲皮素(quercetin，Degree=102)、山奈酚(kaempferol，Degree=39)、木犀草素(luteolin，Degree=33)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，Degree=18)、蒲公英黃銅(3′-hydroxy flavanone，Degree=17)、蒲公英賽酮(Taraxerone，Degree=12)、靛玉紅(indirubin，Degree=11)、綠原酸(Heriguard，Degree=11)、乙酰蒲公英萜醇(Taraxerol Acetate，Degree=11)。表明這9種化學成分可能是金葉拜毒顆粒干預COVID-19的主要中藥成分。因潛在作用靶點與各成分關聯較緊密，故以Degree值的2倍中位數(8)作為主要潛在靶點篩選的閾值，經篩選得到主要潛在靶點有9個，分別為：PTGS2、PTGS1、PPARG、PIK3CG、ACHE、NOS3、NOS2、CASP3、BCL2。上述一種成分與多個靶點作用，多種成分又可共同作用于同一個靶點，體現了金葉拜毒顆粒多成分、多靶點的綜合干預特點。

1.6 構建金葉拜毒顆粒PPI網絡圖 在STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)數據庫中錄入71個潛在靶點，得到PPI網絡關系信息，使用Cytoscape3.7.2軟件對上述數據進行可視化分析，構建PPI網絡圖(圖3)。根據節點度值(Degree)等網絡拓撲學特征進行核心節點的篩選，Degree>27(中位數)的有GAPDH、ALB、TNF、TP53、MAPK3、IL6等31個靶點，與“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖中的靶點相互映射，得到PTGS2、PPARG、NOS3、NOS2、CASP3等5個核心潛在靶點，推測金葉拜毒顆粒的有效成分可能通過作用于上述5個核心靶點進而干預COVID-19。

為了進一步探討這些潛在靶點之間相互作用的生物過程，運用Metascape(https://metascape.org/)以MCODE算法識別靶點之間最密切的生物過程，收集P <0.01，最小計數為3和富集因子> 1.5的術語，并根據其成分靶點之間相互關系的密切程度得到前4個具有豐富生物過程的核心富集模塊(圖4A-4D)，進行富集分析后按P值劃分，選取4個最佳功能描述(表1)，圖4A核心富集模塊主要涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、American trypanosomiasis，Hepatitis B，圖4B核心富集模塊主要涉及HepatitisB、Pathways in cancer， Toll-like receptor signaling pathway，圖4C核心富集模塊主要涉及Toll-like receptor signaling pathway，IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway，圖4D核心富集模塊主要涉及Pathways in cancer、Hepatitis B、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications。

表1 核心富集模塊功能描述

1.7 GO和KEGG富集分析 為探討上述71個交集靶點在防疫COVID-19時的作用機制，運用Metascape3.7.2對71個的靶點進行GO和KEGG富集分析，并按相似度(Kappa)分數> 0.3對生物學過程進行分層聚類，每個節點代表一個聚類，選擇集群中關系最密切的前20個生物學術語作為代表集群的術語，各集群按互相關系構建網絡圖，節點大小與屬于集群的輸入基因數量成正比，連線越粗，代表關系越密切。

GO分析得到1665條生物學過程(圖5A-5B)，KEGG分析得到149條通路途徑(圖6A-6B)，均取結果前20條通路作為重點通路進行展示。按P值大小選擇前20種生物學過程進行描述，主要涉及的GO生物過程有：response to lipopolysaccharide、cytokine-mediated signaling pathway、response to oxidative stress、apoptotic signaling pathway、positive regulation of cytokine production等。主要涉及的KEGG生物過程有AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Apoptosis、HIF-1 signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis等。

2 討論

在2003年“非典”期間，同濟醫院推薦使用金葉拜毒顆粒作為抗SARS病毒的預防和治療,并取得了顯著的效果，得到廣大醫務人員和患者的信賴。在本次抗疫情中，武漢同濟醫院再次推薦使用金葉拜毒顆粒作為新型冠狀病毒肺炎的防治方。金葉拜毒顆粒前身為同濟醫院研發的“抗炎6號”注射劑，源自《醫宗金鑒》古方“五味消毒飲”，主要方藥由金銀花、大青葉、魚腥草、蒲公英4味藥組成，臨床上主要治療風溫肺熱在衛證。其中金銀花性寒味甘，具有清熱解毒、疏散風熱的功效，既能疏風溫在表之邪熱，又能解熱入氣分、血分之熱毒，是常用的清熱解毒中藥之一，是為君藥；大青葉、魚腥草、蒲公英三者共為臣藥，三者共效增強清熱解毒之功。其中金銀花與大青葉合用，前者偏于疏散風熱，后者擅長涼血消斑；金銀花與魚腥草相須使用，前者擅于清熱解毒，后者偏于消癰排膿；金銀花與蒲公英配伍使用，前者適偏于輕宣疏散，后者偏于消腫散結。全方配伍，共奏清熱解毒、疏散外邪之功。

2.1 多成分-多靶點-多通路調控 “免疫-炎癥反應”干預COVID-19當病毒侵入機體，機體在受到病毒感染后會激發自身保護性免疫應答，從而吞噬和隔離病毒，但是失調的、過度的免疫反應會引起免疫激化，從而引起患者體內炎癥因子過度表達而出現“細胞因子風暴”[7-9]。細胞因子風暴可對機體造成嚴重的損害，如透明膜形成、彌漫性肺泡損傷、纖維蛋白滲出等，進而加速肺損傷，而嚴重的肺損傷以及循環系統中的細胞因子風暴會進一步引起全身多器官功能障礙及損傷[10]。目前認為，重癥肺炎產生的原因往往并非是病毒本身，而是感染誘發了機體產生過度的免疫應答，體內失衡的細胞因子系統是造成肺炎及急性肺損傷的一個重要的原因[11]。因此，除了抗病毒治療外，對 COVID-19免疫炎癥治療策略就顯得尤為重要[12]。

本研究共篩選得到金葉拜毒顆粒防治疾病的9個核心潛在化學成分,分別為槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、蒲公英黃銅、蒲公英賽酮、靛玉紅、綠原酸、乙酰蒲公英萜醇。

吳莎等[13]發現槲皮素及穿心蓮內酯均能對已進入細胞內的甲型流感病毒H1N1，登革病毒 2 型，柯薩奇 B 病毒以及呼吸道合胞病毒起一定的抑制作用。此外槲皮素可以使用基于偽病毒的藥物篩選系統抑制H5N1病毒的進入[14]。Zhang R等[15]發現，山奈酚通過抑制TLR4/MyD88介導NF-kB和MAPKs途徑對H9N2病毒誘導的炎癥表現出保護作用，并且山奈酚被認為是潛在治療流感病毒誘導的急性肺損傷的有效藥物。Wu S等[16]研究發現木犀草素可以劑量依賴性減少病毒后代的產生以及CVB3 RNA和蛋白質的合成，發現木犀草素介導的CNB3抑制在機械上是可能的，至少部分是通過抑制p38 MAPK和JNK MAPK的磷酸化，并抑制NF-kB核易位并隨后減弱CVB3(科薩奇病毒B3)感染細胞中的炎性細胞的表達。Li H等[17]發現β-谷甾醇可有效防止由肺炎鏈球素引起的細胞裂解，使小鼠免受肺炎鏈球菌感染。侯京玲等[18]發現蒲公英黃酮對小鼠耳廓、足趾腫脹及大鼠棉球肉芽腫有明顯抑制作用，結果表明蒲公英黃銅對急慢性炎癥具有良好的抑制作用，高劑量的蒲公英黃酮抗炎效果最佳。現代研究顯示蒲公英賽酮可抑制 LPS (脂多糖)誘導的多種炎癥介質的釋放[19]。賴金輪等[20]研究顯示靛玉紅對許多炎癥性疾病都有抑制作用，推測其機理與抑制炎性細胞因子的表達及相關介質的釋放、乃至對上皮細胞的修復的出色表現，預期靛玉紅在炎性疾病的防治上或將扮演越來越重要的角色。抗晶晶等[21]發現綠原酸在小鼠體內體外均能有效降低脂多糖誘導的COX-2的蛋白表達，并能促進 COX-2蛋白的降解．降低脂多糖誘導的COX-2的蛋白水平是綠原酸抗炎的機制之一。Yao等[22]研究表明乙酰蒲公英萜醇通過干擾TAK1和AKt的激活來下調巨噬細胞中促炎性介質的表達，從而阻止NF-kB的激活。

中化學成分靶點與COVID-19有71個共同靶點，通過PPI網絡分析與“藥物-成分-靶點-疾病網絡”相映射發現本方中化學成分主要可能通過調控PTGS2、PPARG、NOS3、NOS2、CASP3這5個核心靶點干預COVID-19。

前列素內環氧化物合成酶(prostaglandin endoperoxidesynthase，PTGS)，又稱環氧合酶 (cyclooxygenase，COX)，是催化花生四烯酸產生前列腺素的關鍵限速酶[23]。在人體內，PTGS 主要存在兩種亞型:結構型 PTGS1 和誘導型 PTGS2。前者表達于所有組織細胞，參與機體正常的生理功能;后者是一種誘導性即刻反應基因，在正常狀態下低表達或不表達，但可在炎癥介質、細胞因子、促 癌 劑、激素等多種體內外因素誘導下表達[24-25]。研究發現細胞色素P450(CYPs)/環氧合酶2(COX-2)途徑中花生四烯酸代謝失調是導致脂多糖(LPS)異常的主要原因[26]。急性肺損傷(ALI)中炎癥反應不受控制，COX-2和可溶性環氧化合物水解酶(sEH)雙重抑制PTUPB通過抑制NLRP3炎性體的激活，在治療急性肺損傷中發揮抗炎作用。PPARG屬于核受體過氧化物酶體增生激活受體(PPAR)亞家族的成員，該基因編碼的蛋白質是PPAR-γ， PPAR-γ參與了免疫、炎癥等細胞過程[27]，包括脂肪細胞的分化、炎癥反應、凋亡、肥胖、動脈粥樣硬化及癌癥等。NOS2(誘導型一氧化氮合酶、eNOS)和NOS3(內皮型一氧化氮合酶、iNOS)是一組同工酶，反應產生的一氧化氮 (NO) 是生物體細胞內及細胞間的重要信號分子, 能調節細胞多種功能，參與炎癥反應、心血管、外周、中樞神經以及免疫等系統生理過程和生物信號的調節[28]。半胱氨酸蛋白酶2(CASP3)是屬于半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成員，是細胞凋亡有序級聯反應下游重要的效應因子[29]。當細胞受到損傷時，其主要表現為線粒體膜損傷，線粒體內的細胞色素釋放到細胞外，激活CASP3從而誘導細胞凋亡[30]。

在對金葉拜毒顆粒作用靶點參與的生物學過程進行GO、KEGG富集分析以及核心模塊分析發現，富集的疾病主要為類似SARS-CoV-2感染的感染性疾病，主要包括病毒、細菌、寄生蟲的感染，例如Hepatitis B 、Chagas disease、Amoebiasis、Herpes simplex infection、HTLV-I infection、Prion diseases。對應的通路主要富集在免疫和炎癥相關通路中，例如HIF-1 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Chemokine signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、p53 signaling pathway。

2.2 金葉拜毒顆粒可能通過“HIF-1信號通路”干預COVID-19 HIF-1信號通路是調解機體缺氧的重要通路，金葉拜毒顆粒中涉及的靶點有BCL2、EGFR、GAPDH、HMOX1、IFNG、IL6、NOS2等，當機體發生缺氧相關反應時，機體會形成以HIF-1為核心，聯合其上下游基因及產物組成復雜的缺氧調控網絡。通過參與某些通路信號、調控相應靶基因的表達、調節細胞凋亡、細胞周期等途徑，使缺氧的細胞和組織能保持氧穩定及耐受低氧狀態[31]。COVID-19組織學檢查顯示雙側彌漫性肺泡損傷伴細胞纖維黏液樣滲出物，肺細胞脫落、肺水腫及透明膜形成，兩肺可見以淋巴細胞為主的間質單核炎性浸潤[32]。不典型肺細胞增大的多核合胞體細胞肺泡腔內可見大核、雙親顆粒狀細胞質和明顯核仁，呈病毒性細胞病變樣改變。臨床則表現為進行性的呼吸困難，呼吸窘迫綜合征，最終死于呼吸衰竭[33]。因此，金葉拜毒顆粒可能通過調控HIF-1信號通路，有助于改善COVID-19患者臨床缺氧癥狀。

2.3 金葉拜毒顆粒可能通過“IL-17 信號通路”干預COVID-19 在KEGG富集分析中發現，金葉拜毒顆粒除了參與圖6中的生物學過程，還參與了IL-17信號通路，Log10(P)= -27.80，Log10(q)=-25.71，參與的靶點主要有CASP3、CASP8、MAPK14、FOS、CXCL2、IFNG、IL6等。IL-17 信號通路是在宿主免疫學中起關鍵作用的通路，在細胞增殖分化、生物因子轉錄與表達及免疫調節方面發揮重要作用, 與腫瘤、器官移植、感染及多種炎癥過程密切相關[34]。在呼吸系統中，IL-17 作為聯系T細胞與中性粒細胞的重要介質, 通過刺激支氣管上皮細胞 、血管內皮細胞和成纖維細胞合成 、釋放 IL-8,GCP-2, MIP-2 與粘附因子等生物因子參與炎癥狀態下中性粒細胞在氣道的募集[35]。另外，IL-17 還刺激支氣管上皮細胞和成纖維細胞合成 、釋放中性粒細胞活化因子 IL-6,并增強 MPO 和彈性蛋白酶活性[36]。《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[37]中首次提出，對于雙肺廣泛病變及重型COVID-19患 者,如 實 驗 室 檢 測 白 細 胞 介 素 -6(interleukin-6，IL-6)升高者，可試用托珠單抗治療。推測托珠單抗有可能通過阻斷“炎癥風暴”進而阻止輕癥COVID-19患者向重癥或危重癥患者轉變，從而降低病死率[38]。因此，可能推測金葉拜毒顆粒可能通過“IL-17 信號通路”調節白細胞介素-6的釋放從而阻斷“炎癥風暴”達到干預COVID-19的效果。

2.4 金葉拜毒顆粒可能通過“EVGF 信號通路”干預COVID-19 金葉拜毒顆粒除了參與圖6中的生物學過程，還參與了EVGF信號通路，Log10(P)= -16.80，Log10(q)= -15.45，參與的靶點主要有MAPK14、HSPB1、NOS3、PIK3R1等。VEGF 信號通路參與到血管新生整個過程，發揮了不可或缺的作用。VEGF及其受體廣泛分布在肺部，不僅存在于肺泡上皮細胞，而且在血管、氣道平滑肌細胞及血管內皮細胞等都有VEGF及其受體的表達[39]。SARS-CoV-2主要通過 2 型肺泡上皮細胞上的血管緊張素轉化酶2( angiotensin-converting enzyme 2，ACE2) 首先感染肺，其最常見的致命并發癥是急性呼吸窘迫綜合征( acute respiratory distress syndrome， ARDS )[40]。ARDS以肺泡上皮損傷和毛細血管通透性增加所致彌漫性肺泡肺水腫及透明膜的形成為主要病理特征，以呼吸窘迫和嚴重低氧血癥為主要臨床表現。發病機制復雜。肺毛細血管內皮細胞損傷是其重要環節之一[41]。Gullen等[42]研究提示，VEGF作用于肺血管內皮細胞使肌動蛋自發生排列改變，細胞間隙形成，血管內皮通透性增加并導致肺水腫和肺泡內蛋白含量增高。陳思峰等[43]認為肺泡上皮屏障和肺毛細血管內皮屏障通透性增高引起肺水腫，肺泡上皮屏障通透性增加不是 SARS-CoV-2 引起的ARDS的唯一主要機制，我們應該對肺毛細血管內皮屏障的破壞引起足夠的重視。因此，推斷金葉拜毒顆粒可能通過“EVGF”信通路減少“炎癥風暴”對肺血管上皮細胞和毛細血管內皮通透性從而干預COVID-2019。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學對金葉拜毒顆粒防治COVID-19進行探索性研究，槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、蒲公英黃銅、蒲公英賽酮、靛玉紅、綠原酸、乙酰蒲公英萜醇這些化學成分作用于PTGS2、PPARG、NOS3、NOS2、CASP3等靶點，參與細胞分化、凋亡、信號傳導等途徑，進而調控免疫和炎癥反應等相關通路、HIF-1信號通路和IL-17信號通路和EVGF信號通路。