急性肺損傷患者血漿miR-221及miR-300表達水平及與預后相關性分析*

曾宗鼎，邢崇浩，鄭輝才，卓 越，李 鎮，杜 莉，陳 亮，張璐璐

三亞中心醫院呼吸內科，海南三亞 572000

急性肺損傷(ALI)是一種氣道及肺實質內急性炎性反應的重癥呼吸系統疾病，其起病急驟，病情進展迅速，病死率極高，對患者生命健康造成極大的威脅[1]。微小核糖核酸(miRNA)作為一類新型的基因調控分子，參與調控細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等過程，可通過影響靶基因的表達而調控炎癥通路和免疫反應，在ALI發病過程中起重要作用[2-3]。近年來的研究發現，miR-221及miR-300在ALI中發生差異表達，有望成為治療ALI的潛在靶點[4-5]。本研究通過檢測ALI患者血漿miR-221及miR-300表達水平，探討血漿miR-221及miR-300表達水平與ALI患者預后的關系，旨在為ALI的診治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年6月三亞中心醫院收治的ALI患者137例，男性87例、女性50例，年齡31～83歲，平均(56.82±10.24)歲。納入標準：符合中華醫學會呼吸病學分會制訂的ALl診斷標準[6]，并結合臨床癥狀及體征確診。排除標準：臨床診斷不明確者，合并惡性腫瘤、血液系統疾病及其他呼吸系統疾病者。本研究經本院倫理委員會批準，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2研究方法 收集ALI患者一般資料，包括年齡、性別、體質量指數、病因、心率、呼吸頻率、平均動脈壓、呼氣末正壓、動脈二氧化碳分壓及動脈血氧分壓等。以ALI患者發病當天為研究起點，ALI患者痊愈出院或死亡作為研究終點，將其分為存活組(90例)和死亡組(47例)。對所有ALI患者采用急性生理學與慢性健康狀況評分系統Ⅱ(APACHEⅡ)評分系統軟件計算APACHEⅡ評分值，APACHEⅡ評分>20分為高危組(63例)，APACHEⅡ評分≤20分為低中危組(74例)。

1.3miR-221及miR-300檢測 所有ALI患者均于發病當天采集空腹靜脈血5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA) 抗凝管中，離心分離血漿。采用ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行實時熒光定量PCR。miRNA逆轉錄反應體系：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特異性莖環引物，0.15 μL 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μL逆轉錄酶(50 U/μL)，1.50 μL 10×反轉錄緩沖液，0.19 μL RNase抑制劑(20 U/μL)，4.16 μL無菌三蒸水；反應條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5min。PCR總反應體系為20 μL:1 μL引物及探針Mix(20×)，10 μL TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μL反轉錄產物cDNA，7.67 μL無核酸酶的水；擴增條件：95 ℃ 10 min 1個循環，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s進行45個循環。每個反應體系中熒光信號達到所設定的閾值的經歷的循環數即為Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-221及miR-300的表達水平。

2 結 果

2.1死亡組和存活組一般資料比較 死亡組平均動脈壓、呼氣末正壓及APACHEⅡ評分與存活組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組性別、年齡、體質量指數、病因、呼吸頻率、心率、動脈血氧分壓及動脈二氧化碳分壓比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 死亡組和存活組一般資料比較

2.2死亡組和存活組血漿miR-221及miR-300表達水平比較 死亡組血漿miR-221及miR-300表達水平均明顯高于存活組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 死亡組和存活組血漿miR-221及miR-300表達水平比較

2.3高危組和低中危組血漿miR-221、miR-300表達水平及病死率比較 高危組血漿miR-221、miR-300表達水平及病死率均明顯高于低中危組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4多因素Logistic回歸分析ALI患者死亡的危險因素 以ALI患者是否發生死亡為因變量(死亡組：Y=1，存活組：Y=0)，將存活組和死亡組有統計學意義的項目：平均動脈壓、呼氣末正壓、APACHEⅡ評分、血漿miR-221及miR-300表達水平進行多因素Logistic回歸分析，發現APACHEⅡ評分、血漿miR-221及miR-300表達水平升高是ALI患者死亡的獨立危險因素，其OR(95%CI)值分別為2.490(1.583～4.206)、3.270(2.247～7.115)、2.683(1.715～6.207)。見表4。

2.5血漿miR-221及miR-300表達水平預測ALI患者死亡的價值 血漿miR-221及miR-300表達水平預測ALI患者死亡的最佳截斷值分別為2.80、1.73。miR-221及miR-300二者聯合預測ALI患者死亡的AUC明顯高于單項miR-221、miR-300，差異有統計學意義(Z=4.426、4.705，P<0.05)，其靈敏度和特異度為92.0%和84.2%。見圖1和表5。

表3 高危組和低中危組血漿miR-221、miR-300表達水平及病死率比較

圖1 血漿miR-221及miR-300表達水平預測ALI患者死亡的ROC曲線

表4 多因素Logistic回歸分析ALI患者死亡的危險因素

續表4 多因素Logistic回歸分析ALI患者死亡的危險因素

表5 血漿miR-221及miR-300表達水平預測ALI患者死亡的價值

3 討 論

ALI是一種病死率高、嚴重危害人類健康的疾病。如何早期預測ALI患者病情嚴重程度及預后，進而針對其進行個體化治療，對提高臨床預后及降低病死率具有重要意義。ZHENG等[7]研究表明，miRNA參與了ALI的發生、發展，在ALI炎性反應和細胞凋亡中起著重要的調控作用，將有望成為ALI的新型生物標志物和治療新靶點。

本研究中死亡組血漿miR-221及miR-300表達水平均明顯高于存活組，高危組血漿miR-221、miR-300表達水平及病死率均明顯高于低中危組，差異有統計學意義(P<0.05)。這說明血漿miR-221及miR-300表達水平升高與ALI患者的病情嚴重程度有關，血漿miR-221及miR-300表達水平高的ALI患者預后較差，發生死亡的風險較高。WANG等[8]研究表明，ALI肺組織miR-221表達水平顯著升高，miR-221的上調則加重了脂多糖誘導的肺部炎癥，在ALI炎癥調節中發揮重要作用。CAO等[9]研究發現，在ALI患者miRNA表達水平明顯升高，且miRNA表達水平變化與ALI患者病情嚴重程度和預后密切相關。

本研究應用多因素Logistic回歸分析，APACHEⅡ評分、血漿miR-221及miR-300水平升高是ALI患者死亡的獨立危險因素。CHHANGANI等[10]研究顯示，隨著APACHEⅡ評分分值增高，重癥患者醫院感染率、住院病死率均明顯升高，APACHEⅡ評分對預測重癥患者的預后有一定的應用價值。本研究ROC曲線顯示，miR-221及miR-300二者聯合預測ALI患者死亡的AUC最大，其靈敏度和特異度較高。說明miR-221及miR-300二者聯合檢測有助于提高預測ALI患者死亡的價值。ZHAO等[11]研究指出，miR-221的表達增強了脂多糖刺激下促炎細胞因子的產生，可加重急性肺損傷和炎性反應，提示miR-221的異常表達參與炎癥性肺疾病的發生發展。FERRUELO等[12]研究認為，miRNA是一類新的基因表達途徑，在炎癥或凋亡中發揮重要作用，可作為ALI診斷及預后的生物標志物。LU等[13]研究發現，miRNA與ALI的疾病發展和疾病嚴重性有關，可作為ALI預后評估的生物標志物，同時也為臨床治療ALI提供新的思路。但本研究為單中心的小樣本研究，其結論可能存在一定的片面性和局限性，今后仍需更多的臨床研究來證實。

血漿miR-221及miR-300表達水平升高與ALI患者預后不良相關，是ALI患者死亡的獨立危險因素，有望作為預測ALI患者預后的新型生物標志物。