內質網應激-自噬-凋亡通路廣西崇左地區壯族早發性乳腺癌BRCA1突變復發患者中的表達變化

林國鴻，羅強，農文偉

（廣西壯族自治區民族醫院 心胸腺體外科，廣西 南寧 530007）

0 引言

中國華南漢族早發性乳腺癌患者的BRCA1和BRCA2基因異常，在廣西地區散發性乳腺癌患者BRCA基因異常表達率高達為90.0%。在課題組前期研究發現[1]，在廣西崇左地區早發性乳腺癌患者復發中BRCA1和BRCA2表達降低可能崇左壯族早發性乳腺癌的發生，二者可能是乳腺癌的復發重要因素，尤其BRCA1的改變可能與其復發關系密切，但早發性乳腺癌BRCA1突變患者的復發機制尚未知。文獻報道，自噬可以促進癌細胞的轉移與活性，而內質網應激則抑制癌細胞的分化與增殖從而誘導癌細胞的凋亡[2]，內質網應激-自噬-凋亡通路平衡調節與腫瘤的復發、轉移密切相關[3]，但在BRCA1突變的廣西崇左地區早發性乳腺癌復發患者中，此通路是否發生改變尚未有文獻報道。因此，本研究擬在前期研究的基礎上，探討內質網應激-自噬-凋亡通路廣西崇左地區壯族早發性乳腺癌BRCA1突變復發患者中的表達變化情況。

1 資料與方法

1.1 資料采集及標本分組

1.1.1 資料采集：本研究經廣西壯族自治區民族醫院醫學倫理學委員批準，術前簽署標本處理知情同意書。收集2010年3月至2016年3月間我院收治的乳腺增生患者10例和早發性乳腺癌復發患者30例。納入標準：①前期研究BCRA1基因表達降低；②女性患者年齡均≤35歲；③疾病最終診斷以術中切取病變組織進行病理學檢測結果為準，受試者均為浸潤性非特殊癌；④臨床分期IIIb以下；⑤早發與復發均盡在本院治療；⑥復發時患者麻醉ASA評級III級以下。排除標準：①非早發性復發乳腺癌；②病理診斷不符合浸潤性非特殊癌；③臨床分期不符；④患者未簽署標本處理同意書。納入研究的患者在組內比較，年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、組織學類型等方面無顯著性差異（P＜0.05）。

1.1.2 標本分組：標本經術中外科切取或診斷穿刺無菌提取后液氮速凍后轉運至-80攝氏度冰箱保存。乳腺增生患者乳腺組織為C組，復發患者的癌組織為A組,復發患者的癌旁組織為B組。

1.2 主要試劑。內質網應激相關蛋白BIP（Immunoglob ulin heavy chain binding protein，免疫球蛋白重鏈結合蛋白）購自（Cell Signaling Technology公司，美國）；自噬相關蛋白 LC3（Microtubules associated protein light chain 3，微管相關蛋白輕鏈3）、P62和Bclin1及凋亡相關蛋白 Bcl-2和bax均購自于英國Abcam公司，辣根過氧化酶標記鼠抗兔IgG（中杉金橋公司，中國）、酶標鼠抗兔IgG（博士德公司，中國），BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜、考馬斯亮蘭R-250染液套裝、TEMED（碧云天公司，中國）。

1.3 Western blotting檢測。采用BCA法檢測各標本的總蛋白濃度。采用煮沸5 min的方法使蛋白變性，十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（均使用12.5%的SDSPAGE）。5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入BIP、LC3、beclin1，P62、bax、bcl-2一抗后4℃過夜后。復溫30 min后加入酶標二抗，ECL法顯色，在Bio-Rad成像儀，獲取蛋白顯色后條帶，Image Lab軟件進行條帶灰度值測量，計算為各個蛋白的相對表達量。

1.4 統計學分析。SPSS 17.0統計軟件，正態分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內質網應激表達結果。與C組比較，A組和B組的ERS相關蛋白BIP表達水平均降低（均P＜0.05）；與A組比較，B組的BIP則表達增加（均P＜0.05）。各組標本的BIP蛋白比較詳見圖1。

圖1 各組標本中BIP的相對表達量比較

2.2 自噬表達結果。在蛋白表達水平，與C組比較，A組和B組的LC3II/I、beclin1表達增加，P62表達降低（均P＜0.05）；與A組比較，B組的LC3II/I、beclin1表達降低，P62表達增加（均P＜0.05）。各組自噬相關蛋白比較詳見圖2。

圖2 各組標本中LC3-II/I、beclin1、P62的相對表達量比較

2.3 凋亡表達結果。在蛋白表達水平，與C組比較，A組和B組的凋亡相關蛋白bcl-2表達升高，bax表達下降（均P＜0.05）；與A組比較，B組的凋亡相關蛋白bcl-2表達升高，bax表達下降（均P＜0.05）。各組凋亡相關蛋白比較詳見圖3。

圖3 各組標本中bcl2、bax的相對表達量比較

3 討論

乳腺癌患者復發的最主要因素是區域淋巴結轉移以及遠處臟器轉移，而BCL2L2、CCNA1、CD44、CTSD和MAP2K7等基因的改變促進了乳腺癌的復發和轉移[4-5]，但處于基因突變下腫瘤的復發機制尚不清楚。在本研究中，提取前期研究篩選BRCA1基因低表達的廣西崇左地區早發性復發乳腺癌患者的乳腺癌組織與癌旁組織進行蛋白免疫印跡分析。結果內質網應激水平降低，自噬程度提升，凋亡水平降低（P＜0.05），此通路的改變可能是受試患者發生復發的機制之一。

綜上可知，乳腺癌細胞內質網應激可以通過促進細胞凋亡抑制細胞增殖，而自噬會降低乳腺癌細胞的凋亡水平，內質網應激-自噬-凋亡通路的平衡調節對癌細胞的耐藥、增殖、分化和轉移發揮促進作用。在本研究中，廣西崇左地區壯族早發性BRCA1突變復發患者的癌組織內質網應激水平降低，自噬水平增加，凋亡程度減弱，內質網應激-自噬-凋亡通路可能參與了其發生發展。本研究將為本地區的早發性BRCA1突變復發患者疾病防治及機制研究提供參考。