胎兒生長受限孕婦血清、胎盤組織中Klotho及VEGFR2蛋白的表達及其臨床意義

劉蕾 朱錦明 李亞楠 彭鳳云

1徐州醫科大學研究生院（江蘇徐州221006）；2徐州婦幼保健院（江蘇徐州221009）

人類基因KL 定位于染色體13q12，由5 個外顯子組成，其翻譯產物蛋白具有膜型和分泌型2種亞型［1］。分泌型Klotho 蛋白（sKL）主要分布于血液中，少量存在于尿液和腦脊液中［2］，其以體液因子的形式存在于循環系統中，人體缺乏KL 蛋白可表現為內皮功能障礙、動脈硬化及血管生成受損等。KUSABA 等［3］證實KL 與VEGR2 和瞬時受體潛在的canonical-1 Ca2+通道相關，以維持內皮細胞的完整性。

胎兒生長受限（fetal growth restriction，FGR）是圍產期死亡的第二大最常見原因［4］。2019年ACOG發布的FGR實踐指南將FGR定義為：估計胎兒體重（estimated fetal weight，EFW）低于相應胎齡第10 百分位數以下的胎兒［5］。FGR 胎兒的圍產期發病率和死亡率以及長期健康缺陷的風險較正常胎兒更高，然而FGR目前缺乏有效的治療方法，早期診斷、篩查高危因素，成為防治重點。目前關于FGR 發病原因及發病機制無明確定義，其中胎盤功能不全與FGR 的發病有著密切聯系，本實驗將通過檢測FGR 孕婦血清、胎盤組織中KL 蛋白及VEGFR2的表達水平，研究其表達水平差異是否影響正常胎盤血管網的形成及其對血管功能的影響，推測其在FGR 發生發展中的可能作用，以期為FGR 的病因提供新的思路，為預測FGR 的發生及評估孕婦胎盤功能提供新的方向，以及為FGR 治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年1月-2020年6月在徐州醫科大學附屬徐州婦幼保健院產科住院分娩的FGR 患者60 例。納入標準：（1）符合相關診斷標標準；（2）產婦及其家屬均自愿簽署知情同意書。排除標準：（1）自身免疫缺陷等疾病；（2）多胎妊娠；（3）伴嚴重肝腎等重要器官障礙性疾?。唬?）受染色體和/或先天性異常影響的孕婦；（5）產前篩查提示胎兒可能存在發育異常；（6）父母雙方身材矮小或有家族性FGR 病史，另選擇同期正常孕晚期孕婦30 例作為對照組，對照組病例排除內外科合并癥和產科并發癥。其中，FGR 患者60 例，根據診斷時的孕周，將其分為：早發型FGR30 例（發病孕周＜32 周）；晚發型FGR30 例（發病孕周≥32周）［6-9］。3 組均為單胎妊娠。3 組間平均年齡、孕次、產次差異無統計學意義（P＞0.05），分娩孕周之間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。研究對象均征求本人書面同意并經徐州醫科大學附屬徐州婦幼保健院倫理委員會同意（批準號：徐州市婦幼保健院［2020］倫審第（01）號）。

表1 三組孕婦一般情況比較Tab.1 The general situation of pregnant women in three groups was compared±s

表1 三組孕婦一般情況比較Tab.1 The general situation of pregnant women in three groups was compared±s

注：與正常妊娠對照組相比，*P ＜0.05

分組 總例數 年齡（歲） 孕次 產次 分娩孕周正常妊娠對照組3028.50±4.422.06±1.200.90±0.8839.00±1.26*早發型FGR晚發型FGR F值P值30 30 30.96±5.13 30.20±6.09 1.725 0.184 2.16±1.46 1.93±1.28 0.235 0.791 0.90±0.79 0.61±0.81 1.012 0.368 36.50±2.40 37.53±1.94*12.654＜0.001

1.2 ELISA 法檢測sKL、sVEGFR2所有的入組的研究對象均于入院后當日抽取肘靜脈血4 mL，離心，留取上清液，應用ELISA 方法檢測血清中sKL、sVEGFR2 的表達水平。

1.3 免疫組化檢測胎盤組織中KL、VEGFR2采用免疫組化SP 二步法檢測胎盤組織中KL、VEGFR2，一抗為兔抗人單克隆KL 抗體（英國Abcam 公司）、VEGFR2 單克隆抗體（英國Abcam 公司）嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。根據陽性細胞百分率和細胞染色強度確定Klotho 及VEGFR2 的表達水平。參照FROMOWITZ 等［10］的綜合計分法進行半定量分析，根據陽性細胞分布范圍和染色強度確定蛋白的表達水平。以胞膜或胞質出現明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞，無著色或與背景顏色一致的為陰性細胞。陽性細胞百分數：≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～49%為2 分，≥50%為3 分；陽性細胞著色強度：無著色為0 分，淺棕褐色為1 分，棕褐色為2 分，深褐色為3 分；兩項評分相加：0～1 分為陰性，＞1 分為陽性。

1.4 Western blot 檢測胎盤KL、VEGFR2 蛋白量表達用蛋白提取試劑盒提取組織蛋白，并用BCA 法進行蛋白定量。配制SDS-PAGE 凝膠，電泳；切膠，電轉，脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h，放入KL 單抗（1∶1 000）、VEGFR2 單抗（1∶1 000）孵育過夜，洗膜，加入相應二抗（1∶5 000）孵育；洗滌后曝光，以β-actin 作為內參照。蛋白的相對表達量用待測蛋白與β-actin 的灰度值比值計算。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定胎盤KL mRNA、VEGFR2 mRNA 的表達量采用Trizol 法處理組織樣品，提取總RNA 逆轉錄為cDNA。后進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，目的基因KL 引物序列，上游：5′-CTGGATGGTATCAATCTTTGCG-3′，下游：5′-ATCTGCAGCATAACGATAGAGG-3′，目的基因VEGFR2 引物序列，上游：5′-GGAGCTTAAGAATGCATCCTTG-3′，下游：5′-GATGCTTTCCCCAATACTTGTC-3′，目的基因擴增30個循環，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參對照，計算相對含量。最后通過2-△△CT法計算各組表達水平的倍數差異。

1.6 統計學方法采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計分析。檢驗數據正態性及方差齊性后，計量數據以計算，多個樣本均數比較采用單因素方差分析；計數資料使用例數或（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA 檢測結果結果顯示FGR 組孕婦血清中sKL、sVEGFR2 表達低于正常妊娠對照組（P＜0.05），其中早發型FGR 組和晚發型FGR 組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三組孕婦外周血中sKL、VEGFR2 的表達量Tab.2 Expression levels of sKlotho and VEGFR2 in peripheral blood of three groups of pregnant women x±s，pg/mL

2.2 免疫組化結果結果顯示KL蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞的細胞膜、細胞質及胎盤血管內細胞中（圖1），VEGFR2 主要表達于胎盤血管內皮細胞中（圖2）。FGR 組中KL、VEGFR2 蛋白表達低于正常妊娠對照組（P＜0.05），其中，早發型和晚發型差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 KL 在胎盤組織中的表達（DAB 染色，×400）Fig.1 Expression of KL in placental tissues（DAB staining，×400）

2.3 三組孕婦胎盤組織中KL、VEGFR2 蛋白及mRNA 表達水平FGR 組中KL mRNA、VEGFR2 mRNA 及蛋白表達水平均低于正常妊娠對照組（P＜0.05），其中早發型FGR 組和晚發型FGR 組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

3 討論

KL 基因編碼α-Klotho、β-Klotho 及KL 相關蛋白，通過轉錄形成兩種轉錄本：一種是全長，該轉錄本可翻譯為由1 012 個氨基酸組成的分子量為130 kD 的跨膜蛋白，即膜型；另外一種轉錄本可翻譯為N 端的549 個氨基酸，分子量為65～70 kD 的分泌型蛋白［11］。血液循環中的KL蛋白由膜型KL蛋白經水解產生的胞外區片段和分泌型KL 蛋白組成。缺乏KL 蛋白會影響內皮細胞的完整性，其表達與血管鈣化、動脈粥樣硬化、腎病及腫瘤等多種疾病有關。在成人中，血管內皮生長因子（VEGFs）是胚胎發育和血管形成過程中血管發育的重要調節因子。已有研究表明，在哺乳動物中，存在幾個不同的剪接變體和加工形式的五種VEGF 配體，這些配體以重疊的模式結合三種酪氨酸激酶受體（RTKs），即VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3，以及共受體，如硫酸肝素蛋白多糖（HSPGs）等［12］，sVEGFR2是一種免疫激活受體，由內皮細胞表面蛋白水解形成，伴隨配體誘導下VEGFR2 的形成，在刺激新血管發生與生長以及維持血管壁的完整性和正常通透性方面均有重要意義。KUSABA 等［8］證實VEGF 介導的Ca2+信號通路通過與KL 的相互作用而受到嚴格的調控，并且KL 在VEGF 介導的血管活動以及內皮功能的維持中發揮重要作用。

圖3 三組孕婦胎盤組織中KL mRNA 及VEGFR2 mRNA 的表達Fig.3 Expression of KL mRNA and VEGFR2 mRNA in placental tissues of three groups of pregnant women

宮內生長受限常伴有胎盤血管疾病，胎盤功能異常導致的胎盤灌注不良是FGR 最常見的病因［13］，主要表現為胎盤血管建立不全、胎盤滋養細胞侵入功能障礙，影響子宮螺旋小動脈生理性重鑄，使胎盤血流量減少，從而影響胎兒血供。與正常妊娠胎兒胎盤相比，FGR 胎兒胎盤病理形態學改變為胎盤體積縮小；鏡下病理改變表現為絨毛內間質增生、鈣化，纖維素樣壞死增多；絨毛內血管減少甚至消失，管腔狹窄，甚至閉塞［14］。以上改變導致胎盤血流不足，交換面積減少，限制了氧及營養物質的攝取和轉運，是造成FGR 胎盤功能減退的形態學基礎［15］。在KL 蛋白與妊娠相關疾病中，現有研究表明，與正常妊娠相比，子癇前期胎盤KL mRNA 和蛋白表達降低，子癇前期產婦血清中KL降低［16-17］。FRANKLIN 等［18］報道稱KL蛋白在小于胎齡兒（small for gestational age infants，SGA）臍血及中表達下降，并與血管生成素2 相關，可能在血管介導的胎盤衰老加速導致的宮內生長受限中發揮作用，另有研究觀察到，與正常出生體重組相比，巨大兒妊娠胎盤中KL 基因表達較高［19］。FGR 同妊娠期高血壓與妊娠期糖尿病等妊娠并發癥一樣，都有著胎盤血管及微循環的改變，推測KL 蛋白可能通過調控胎盤血管生成，影響胎盤循環，從而參與與胎盤血管病變相關的一系列妊娠并發癥的病理生理改變。

本研究結果顯示KL 蛋白主要定位于胎盤合體滋養細胞的細胞膜與細胞質及胎盤血管內皮細胞中，而VEGFR2 主要定位于胎盤血管內皮細胞中，從蛋白及mRNA 水平上均顯示KL、VEGFR2 表達在FGR 組中低于正常妊娠對照組（P＜0.05），而在早發型FGR 與晚發型FGR 中，KL、VEGFR2 的表達差異無統計學意義（P＞0.05），同時在FGR 組的胎盤病理切片中觀察到了程度不同的血管灌注不足，終末絨毛血管形成欠佳、纖維素樣壞死缺血，絨毛間質纖維化，合體結節增多，及小灶狀梗死、鈣化。因此筆者推測KL 蛋白與VEGFR2 相互作用，影響正常胎盤血管形成和發育，造成胎盤異常病理改變，從而導致胎盤血流進一步減少，胎盤發育不良，血管鈣化、微絨毛數量和密度明顯減少，阻礙母兒營養交換，從而導致FGR 的發生。ELISA檢測結果顯示FGR 組孕婦血清中sKL 及sVEGFR2的含量低于對照組（P＜0.05），其中早發型FGR組與晚發型FGR 組比較差異無統計學意義（P＞0.05），推測sKL 可能作為一種體液調節因子，與VEGFR2共同作用，通過體液循環，最終作用于胎盤，調控胎盤血管生長，sKL 蛋白表達減少，導致血管鈣化，胎盤血管功能受損，胎兒營養缺乏，進而發展為FGR。早發型FGR 組與晚發型FGR 組雖差異無明顯統計學意義（P＜0.05），但早發型FGR 孕婦外周血清中sKL 蛋白含量的均值低于晚發型FGR，有研究［20］表明早發型FGR 胎盤螺旋動脈重構缺陷，周圍缺氧干擾絨毛發育，胎盤效率降低較晚發型FGR更常見，早發型FGR可能存在更早期的胎盤血管功能障礙，較晚發型FGR 在病理生理上表現的更為典型，本次研究的孕周為孕晚期，而在孕晚期早發型FGR 孕婦及晚發型FGR 孕婦均已形成胎盤不可逆的病理改變，這可能是造成KL 與VEGFR2的表達在孕婦胎盤及血清中表達無明顯差異的原因。

綜上所述，本研究表明KL 蛋白、VEGFR2 蛋白在FGR 孕婦母體血清及胎盤中的表達量降低，提示KL 蛋白可能與VEGFR2 共同作用參與FGR 的發生發展，推測KL 通過與VEGFR2 相互作用，調節胎盤血管內皮功能，從而影響胎盤胎兒循環。KL 與VEGFR2 具體在胎盤血管上的作用機制有待進一步研究，可以從細胞水平探討KL 與VEGFR2在胎盤血管形成上的相互作用機制，本文局限于孕晚期研究，可進一步追溯FGR 孕婦孕早期及孕中期，以期為FGR 的預測、預防提供一個新的靶點，以便于最大程度降低FGR 母兒風險。