兒童髓母細胞瘤腦脊液循環腫瘤DNA檢測可行性分析

孫艷玲 劉晶晶 李苗 任思其 劉妍 張金 李舒婷 龔小軍 王圓 杜淑旭 武萬水 孫黎明 田永吉

1首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院兒科（北京100038）；2首都醫科大學附屬北京天壇醫院小兒神經外科（北京100050）

髓母細胞瘤（medulloblastoma，MB）是兒童常見的惡性腦腫瘤，約占所有中樞神經系統腫瘤的20%，目前在手術、全腦全脊髓放療以及輔助化療的多模式治療下，標危組5年生存率可達85%，高危組可達70%，但仍有近30%患者出現復發及進展，而一旦復發或進展，中位生存期僅有1年左右，2年生存率25%，總生存率不超過10%［1-2］。在2016年［3］的中樞神經系統腫瘤分類中對MB 增加了分子分型，然而一旦病情進展或復發，82%呈腦脊膜播散伴或不伴有局部復發，僅25%可獲得再次手術或活檢獲得病理組織［4］，亟待尋找一種新的可供選擇的分子檢測手段用于評估基因突變狀態。近年來，隨著超敏感測序技術的發展，腫瘤的精準個體化治療成為目前治療的方向。數字PCR（dPCR）可以檢測出豐度為0.01% ～0.1%的突變等位基因，而新一代測序（next-generation sequencing，NGS）可平行檢測多種突變。循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的半衰期不到兩個小時，可動態反應腫瘤的實時情況。2016年FDA 首次批準液態活檢技術-血液ctDNA 的測定用于非小細胞肺癌中EGFR 突變的診斷和靶向治療，以及早期復發動態監測。然而由于血腦屏障的存在，原發腦腫瘤患者的血漿中罕有檢出ctDNA。近來越來越多的研究顯示，在中樞神經系統原發腫瘤（腦膠質瘤為主）及轉移癌的患者腦脊液中可以檢測出ctDNA，陽性率70%［6］，但關于兒童MB 尚缺乏相關數據及研究。本課題通過對比兒童MB腫瘤組織和腦脊液ctDNA 檢測結果，確定腦脊液液態活檢在MB 中的可行性，探索腦脊液液體活檢用于MB 動態監測的意義，并對進展及復發患兒再次進行基因診斷以實施個體化的精準治療。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2019年4月至2019年12月北京天壇醫院小兒神經外科收治的患兒6 例，術前均依據頭顱核磁影像學診斷為MB，以及同期于我院住院的初治MB 患兒1 例，頭顱及全脊髓核磁增強掃描提示存在脊髓播散MB。

1.2 髓母細胞瘤分類診斷標準及分期術后組織標本經天壇神經外科病理研究所和北京宣 武醫院病理科確診為MB 并行病理分型，共分為四種病理類型：經典型（classic medulloblastoma，CMB）、促纖維增生/結節型（desmoplastic/nodular medulloblastoma DMB）、廣泛結節型（medulloblastoma with extensive nodularity，MBEN）、大細胞/間變型（large cell/anaplastic，LC/A）；TAYLOR 等［8］提出MB 包括4 種獨立的分子學亞型：WNT、SHH、3 型（Group3）、4 型（Group4），3 型和4 型屬于非WNT/SHH 亞型。根據Chang′s 分期［9］將腫瘤分為5 期：M0 期指無腫瘤轉移者，M1 期為僅腦脊液中有腫瘤細胞，M2期為僅腦部核磁共振成像（MRI）發現腫瘤轉移灶，M3 期為脊髓MRI 發現腫瘤轉移灶，M4 期為神經系統外發現腫瘤轉移灶。

1.3 方法

1.3.1 采樣術中樣本留取：術中先行枕后正中入路留取腦脊液標本4 ～6 mL 及外周血streck 采血管4 mL。術后3 ～4 周樣本留取：于術后3-4 周首次化療前行腰椎穿刺留取腦脊液2 ～4 mL，并外周血streck 采血管4 mL。采集后4 ℃運輸，2 ～3 h內-4 ℃離心10 min，分離后于-80 ℃保存。

1.3.2 ctDNA 提取腦脊液樣本與200 μL 的Q Sepharose 陰離子交換樹脂混合，置于旋轉儀上室溫孵育，將收集的沉淀利用Micro Bio-SpinTM（Bio Rad）色譜柱清洗后洗脫，洗脫后的DNA 用Qia Quick columns（Qiagen）進一步純化。

1.3.3 ctDNA 的目標區域捕獲和建庫方案目標捕獲和MB 密切相關基因的全部外顯子區域，以血液作為參照樣本排除胚系突變，用Covaris 破碎儀將基因組DNA（石蠟組織和血液）隨機打斷成長度為150 bp 大小的片段。將基因組DNA 片段以及腦脊液上清ctDNA，分別作為模板配制第一步PCR體系，將PCR 反應體系利用Rain Drop Source（Rain Dance Technologies）系統將單個分子分散至油包水液滴中，制備好的油滴經第一步PCR 擴增捕獲目標區域，破壞油滴釋放擴增子，再通過第二步PCR添加適用于illumina 測序平臺的接頭序列，磁珠法純化DNA，對完整的DNA 文庫用Agilent 2100 檢測儀檢測片段大小，利用文庫定量試劑盒精確定量DNA 濃度，質檢合格的文庫進行后續實驗。

1.3.4 髓母細胞瘤循環腫瘤DNA 的高通量測序對于游離DNA 中含量極低的循環腫瘤DNA片段，目標測序深度為20 000 ×，根據捕獲區間大小計算文庫輸入量。目標捕獲區域片段長度主要集中在160 ～200 bp 之間，選擇PE150 測序策略通illumina 公司的HiSeq X Ten 測序儀進行高通量測序，下機數據Q30在90%以上的進行后續生信分析。

1.3.5 高通量測序數據進行生物信息學分析對獲得的下機數據按index 進行拆分，得到原始測序序列（Raw Reads）。對Raw Reads 的數據量、堿基含量、堿基質量等結果進行統計，過濾不合格的數據，得到Clean Reads。將Clean Data 按分段比對的方式比對到參考基因組上。修正后的比對結果將作為輸入文件進行突變檢測、注釋和統計。在體細胞SNV、Indel 的檢測過程中，對正常樣本和腫瘤樣本進行成對分析，以檢測出體細胞內與腫瘤發生相關的突變。

2 結果

2.1 腦脊液上清較腦脊液沉淀檢出更豐富基因突變采用Agilent 2100 生物分析儀對標本ctDNA 片段大小進行進行質控分析，3 例在150 ～200 bp 處沒有峰值，而在2 885 bp 處出現峰值，非ctDNA 片段，質控不合格，建庫失敗，未進行基因檢測。樣本192D360 采用952 基因對腦脊液上清、腦脊液沉淀及組織標本進行比對，腦脊液上清中較腦脊液沉淀可以檢測出更多的基因突變，且這些突變囊括MB 相關的重要基因（圖1）。

2.2 腦脊液基因突變檢出較組織更豐富4例建庫成功的患兒，男3 例，女1 例，年齡3 ～7 歲；CMB、DMB 各2 例；M0 期2 例；M2、M3 期各1 例；SHH、G4各2 例；3 例于術中采集ctDNA，1 例于腰穿時采集ctDNA。采集的ctDNA 濃度在0.137 ～57 ng/μL 之間。腦脊液SNV 檢出較組織更豐富（13/11、25/12、24/10）。腦脊液檢測出MB 相關重要基因突變，陽性率75%。組織檢測出MB 相關重要基因突變，陽性率50%。CSF 檢測出7 個MB 相關基因突變，組織檢測出2 個MB 相關基因突變（表1）。

表1 臨床資料及基因突變檢出情況Tab.1 Clinical data and gene mutation detection status

3 討論

MB 是兒童常見的惡性腦腫瘤，總體發病率2.34 ～5.96/100 萬。隨著基因組學的完善，對于MB 的生物學特征有了更進一步的理解。MB 現在被認為是不同分子病理疾病實體的總稱，并在2016年的CNS 分類［3］中被分為WNT、SHH-TP53 野生型、SHH-TP53 突變型、非-WNT/非-SHH（包括Group3 和Group4），有MYC 擴增或TP53 突變的患者總體預后較差。但目前針對兒童MB 的ctDNA的系統性監測鮮有報道。

2016年FDA 已批準液態活檢技術用于非小細胞肺癌中的EGFR 突變檢測，且已有研究發現液體活檢作為一種無創檢測技術，可以用于肺癌的早期復發動態監測，甚至可以比影像學檢查提前一年發現癌癥復發的跡象［10］。現在血漿ctDNA 已被用于多種腫瘤的診斷、預后判斷及精準治療，如胰腺癌、肝細胞癌、前列腺腫瘤、直腸癌、甲狀腺癌等［11-13］。與經典的組織病理相比，液體活檢克服了傳統組織活檢的侵入性、取樣困難等局限性，使腫瘤的實時動態監測成為可能。而且ctDNA 的遺傳信息和腫瘤組織有良好一致性，可以動態反映腫瘤基因譜特征［14］。

BETTEGOWDA 等［15］針對640 例腦腫瘤患者進行血漿ctDNA 測定，其中136 例為14 個癌種的腦轉移癌，41 例為腦膠質瘤、MB 等原發腦腫瘤，原發腦腫瘤敏感性低于其它腫瘤，在神經系統腫瘤患者中，腦脊液與腫瘤細胞接觸更為親密。腦脊液腫瘤細胞與原發腫瘤組織相匹配，但也有差異，特定的基因組區域在腦脊液腫瘤細胞中經常改變。SHANKAR 等［16］發現原發腦腫瘤的腦脊液ctDNA濃度明顯高于血漿ctDNA 濃度，可檢測到ctDNA的患者比未檢測到ctDNA 的患者生存質量更差，ctDNA 分析可檢測到相應組織樣本中所缺失的突變。SIMONELLI 等［6］回顧ctDNA 液體活檢在腦膠質瘤患者中的應用歷史，靈敏度約為70%，在腦脊液樣本中檢測到TERTp 突變，靈敏度為92%，CSF-tDNA 中的低TERTp 突變總體存活時間明顯更長。ctDNA 的液體活組織檢查是診斷膠質瘤，特別是彌漫性中線膠質瘤的一個很有前途的工具。PAN 等［17］提示基于數字PCR 和靶向擴增子測序的方法對CSF ctDNA檢測是有效且高靈敏度的。ESHINI等［18］研究表明，88%的DMG 患者的腦脊液上清液中鑒定出H3K27M，其中CSF 中ctDNA 的富集程度最高（診斷時達75%）。可嘗試作為小兒彌漫中線膠質瘤監測和細胞體外治療反應的可行方法。

圖1 192D0360 腦脊液上清、腦脊液沉淀及組織基因突變Fig.1 Gene mutations in the CSF supernatant，CSF precipitate and tissue of sample 192D0360

SPINDLER等［19］通過PCR及測序法證實血漿中ctDNA 分子比非突變的ctDNA 分子短。UNDERHILL 等［20］在大鼠異種移植模型中測定ctDNA 的片段在134 ～144 bp 之間，盡管這種縮短的原因尚未明確。在本研究中，最初3 例采樣后直接-80 ℃凍存，之后統一進行復蘇離心ctDNA 提取，采用Agilent 2100 生物分析儀質控分析發現非ctDNA 片段，考慮存在細胞破壞，大片段基因組干擾，無法進行深度測序，排除實驗外。后腦脊液樣本采集后4 ℃運輸，2 ～3 h 內行-4 ℃離心10 min，分離后于-80 ℃保存。調整實驗流程后，樣本192D360 做為預實驗，提取DNA 后應用Agilent 2100 進行DNA片段測試，在150 ～200 bp 處顯示有峰值，采用952基因成功測序，對比腦脊液上清、沉淀及組織標本基因突變檢出情況，腦脊液上清共檢出37 個基因突變，腦脊液沉淀共檢出17 個基因突變，共有突變5 個，其中與MB 密切相關的SMARCA4、TP53、KDM5A 三個基因突變在腦脊液樣本中檢出。SMARCA4 在上清和沉淀都有檢出，TP53 和KDM5A 在上清檢出，提示腦脊液上清中或許可以檢測出更多的基因突變，且這些突變囊括MB 相關的重要基因，與PENTSOVA 等［21］研究一致，確立以腦脊液上清做為后期研究的方向。本組數據顯示CSF 和腫瘤組織檢出Indel 一致性高，而SNV 一致性低。腦脊液SNV 檢出較組織更豐富。腦脊液MB 相關基因突變檢出陽性率75%，組織MB 相關重要基因突變檢出陽性率50%。腦脊液檢測出KMT2D、KMT2C、TP53、NF1、PIK3CA、SMARCA4、KMD5A 等MB 相關基因突變，組織檢測出KMT2D、SMARCA4 等MB 相關基因突變，分析可能與ctDNA片段短150 bp，測序深度達20000x 有關［22］。但本研究數據尚少，需進一步擴大樣本量并多中心研究明確。

綜上所述，腦脊液ctDNA 作為液體活檢在MB 診斷中有一定作用。現有的研究提示腦脊液ctDNA 的檢測對于提示疾病進展及預后具有一定的作用，但囿于腦脊液標本量以及兒童MB 基因突變的檢出率及突變豐度等，目前對于MB 的進展、復發的判斷仍以影像學檢查為主。本研究初步提出腦脊液液體活檢在MB 的診斷中是可行的，摸索了最優化的實驗條件，提示尤其在復發MB 患兒無法手術獲得組織標本時腦脊液ctDNA 檢測可能為進一步的個體化治療的提供方向，是一個初步的嘗試，ctDNA 的濃度及基因突變程度對預后生存期意義還有待進一步觀察，后續會進行更大樣本的驗證。