UFC1在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達研究

田祖國 高陸 劉水玉 翁春嵐

遵義醫科大學附屬醫院血液內科（貴州遵義563000）

彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）最常見的類型，其發病率占NHL 31% ～34%［1］，我國DLBCL 的發病率更高，統計顯示我國DLBCL 占所有淋巴瘤的40.1%，占NHL 的45.8%［2］。聯合免疫化療顯著改善DLBCL 療效［3］，但由于DLBCL 具有高度異質性，仍有約40%的DLBCL 患者表現復發耐藥導致治療失敗，而尋找新的靶標對DLBCL 的診療具有重要意義［4］。UFC1（ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1，UFC1）是一個新鑒定的類泛素結合酶E2，有研究顯示其在乳腺癌組織中明顯高表達［5］。本研究應用免疫組化方法（immunohistochemical，IHC）檢測DLBCL中UFC1 的表達情況，并聯合應用多個生物數據庫研究UFC1 在DLBCL 中的表達情況，分析UFC1 表達與DLBCL 的臨床特征、生存預后的相關性，為DLBCL 的臨床診療提供新的依據和潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 組織標本免疫組化

1.1.1 標本收集收集遵義醫科大學醫學附屬醫院病理資料，篩選病例資料相對完整的40 例初治DLBCL 和20 例反應性淋巴結炎的病理組織石蠟標本，采用IHC 法檢測UFC1 表達情況，組織標本均取自淋巴結腫塊。納入標準：（1）病理學明確診斷為DLBCL；（2）有完整的整體評估資料，包括ECOG 評分、LDH、影像檢查、IPI 評分等；（3）完成規范的DLBCL 化療療程。排除標準：（1）非DLBCL 的其他類型淋巴瘤及腫瘤；（2）無完整的臨床資料；（3）未治療或者治療不規范者。其中男性26 例，女性14 例；年齡≥60 歲19 例，＜60 歲21 例；AnnArbor分期Ⅰ-Ⅱ期8 例，Ⅲ-Ⅳ期32 例；ECOG 評分＜2 分25 例，≥2 分15 例；有B 癥狀16 例，無B 癥狀 的24 例；有結外浸潤22 例，無結外浸潤的18 例；IPI評分0 ～1 分10 例，2 分18 例，3 分10 例，4 ～5 分2 例。實驗研究方案經過醫院倫理委員會審核。

1.1.2 主要試劑Anti-UFC1 antibody（Ab-cam，ab189252），免疫顯色試劑盒EnVisionTMFLEX+，Mouse，HighpH，（Link），DAKO，K800211）。

1.1.3 免疫組化染色石蠟切片按En Vision 兩步法染色，由2 名病理科醫師讀片判斷，采用免疫組化染色評分（immunoreactive score，IRS）進行判定，以陽性細胞數評分加染色強度評分之和進行綜合評分。0 ～1 分為陰性，用（-）表示；2 ～3 分為低表達，用（+）表示；4 ～5 分為中表達，用（++）表示；6 ～7 分為高表達，用（+++）表示；（+）-（+++）均視為陽性表達。

1.2 GEPIA數據庫利用GEPIA數據庫［6］（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析UFC1 在DLBCL 和正常組織中的差異表達，分析步驟：（1）Expression DIY 板塊中選擇Boxplot；（2）Gene 輸入UFC1；（3）Datasets Selection 選擇DLBC；（4）LogScale 選擇否；（5）其余參數選項為默認。

1.3 GEO 數據集在GEO 數據庫［7］（GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索篩選DLBCL 數據集，分析UFC1 的差異表達，及UFC1 表達與DLBCL臨床特征及生存預后相關性。

1.3.1 GSE9327 數據集GSE9327數據集［8］檢測了反應性淋巴結炎（reactive lymphadenitis）和淋巴瘤基因表達差異，包含8 例反應性淋巴結炎和38例套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、38例慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic lymphoma，CLL）、9 例伯基特淋巴瘤（burkitt′s lymphoma，BL）、27 例脾邊緣區淋巴瘤（splenic marginal zone lymphoma，SMZL）、36 例彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）及33 例濾泡淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）；應用該數據集分析UFC1 在反應性淋巴結炎和包括DLBCL 的淋巴瘤中的表達變化。

1.3.2 GSE10846 數據集GSE10846數據集［9］包含采用R-CHOP 方案治療233 例DLBCL 的UFC1 基因表達值及患者的性別、年齡、臨床分期、結外浸潤及生存時間等臨床信息。基于該數據集探討UFC1 表達與DLBCL 臨床特征及生存預后相關性。

1.4 OSdlbcl 數據庫運用OSdlbcl 數據庫［10］（OSdlbcl，http：//bioinfo.henu.edu.cn/DLBCL/DLBCLList.jsp）檢索UFC1 表達與DLBCL 預后關系。分析步驟：（1）Gene symbol：UFC1；（2）Data Source：TCGA；（3）Survival：PFS，OS；（4）Split patients by：Upper 50%；（5）其余參數均選擇All。

1.5 Linkedomics 數據庫應 用Linkedomics 數據 庫［11］（LinkedOmics，http：//linkedomics.org）分 析DLBCL 中UFC1 的共表達基因及GSEA 富集分析。分析步驟：（1）腫瘤類型為TCGA_DLBC；（2）選擇RNAseq 數據；（3）輸入基因名稱UFC1；（4）目標分析數據為RNAseq；（5）選擇Pearson Correlation檢驗。

1.6 String-DB 數據庫運 用String 數據 庫［12］（String，https：//string-db.org）分析UFC1 蛋白互作關系。分析步驟：（1）輸入基因：UFC1；（2）物種：Homo sapiens；（3）置信度：Medium 0.4；（4）最大相互作用：20。

1.7 統計學方法應用SPSS 25.0 進行統計分析，組織UFC1 免疫組化結果采用秩和檢驗；數據集GSE9327 基因表達差異分析采用Graphpad Prism 8.0 分析及作圖；數據集GSE10846 資料臨床特征分析采用卡方檢驗；生存分析采用Graphpad Prism 8.0 分析及作圖；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織免疫組化組織染色顯示UFC1主要在細胞質中陽性表達，部分細胞核有少量陽性表達。UFC1 蛋白在40 例DLBCL 和20 例reactive lymphadenitis 組織中IHC 檢測呈+、++、+++表達的鏡下表現如下（圖1）。DLBCL中UFC1蛋白呈-、+、++、+++者分別為0、4、16、20 例；反應性淋巴結炎中UFC1 蛋白呈-、+、++、+++者分別為3、14、2、1 例；UFC1 表達在DLBCL 和反應性淋巴結炎中差異有統計學意義（P＜0.001，表1）。

圖1 淋巴結組織中UFC1 蛋白的表達（10×40）Fig.1 Positive Expression of UFC1 protein in lymph node samples（10×40）

表1 UFC1 表達在DLBCL 和反應性淋巴結炎中的表達Tab.1 UFC1 expression in patients with DLBCL and Reactive lymphadenitis例

2.2 數據庫中UFC1 在淋巴瘤中的表達

2.2.1 GEPIA 檢索UFC1 在DLBCL 中的表達GEPIA 結果顯示47 例DLBCL 和337 例正常組織的UFC1 表達明顯差異，DLBCL 中UFC1 表達異常升高，差異有統計學意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 GEPIA 在線分析顯示DLBCL 中UFC1 表達顯著高于正常組織Fig.2 UFC1 expression in DLBCL was significantly higher than normal tissues by GEPIA analysis

2.2.2 GEO 數據庫中UFC1 的表達GSE9327 數據集分析顯示，與反應性淋巴結炎相比，在DLBCL中UFC1 基因表達明顯升高（P＜0.0001），同時在MCL、MZL、CLL、BL 中，UFC1 基因表達也明顯升高，但在濾泡淋巴瘤中表達不升高（圖3）。

圖3 GSE9327 數據集分析顯示UFC1 在DLBCL、MCL、MZL、CLL、BL 中呈高表達Fig.3 UFC1 is highly expressed in DLBCL，MCL，MZL，CLL and BL in GSE9327

2.3 UFC1 表達與DLBCL 的臨床特征相關性GSE10846 數據集分析顯示在DLBCL 患者中，UFC1在大于60 歲老年患者（P= 0.003）和non-GCB 型DLBCL 中表達更高（P= 0.015），而在患者性別、LDH、結外浸潤、臨床分期及ECOG 評分中差異無統計學意義（表2）。

2.4 UFC1 表達與DLBCL 預后相關性

2.4.1 GEO 數據庫分析GSE10846 數據集分析顯示UFC1 高表達的DLBCL 患者總生存期（overall survival，OS）明顯差于UFC1 低表達患者，差異有統計學意義（P=0.0326，圖4）。

表2 GSE10846 中UFC1 表達與DLBCL 患者臨床病理特征的關系Tab.2 Association between UFC1 expression and clinicopathological characteristics in GSE10846例（%）

圖4 GSE10846 分析顯示UFC1 高表達的DLBCL 患者OS較差Fig.4 The OS of DLBCL patients with high expression of UFC1 was inferior（P=0.032 6）in GSE10846

2.4.2 OSdlbcl中檢索UFC1表達與DLBCL預后相關性在線數據庫OSdlbcl 中檢索結果顯示UFC1高表達的DLBCL 患者的無進展生存期（progression free survival，PFS）差于UFC1低表達患者（P=0.015 9），同樣的UFC1 高表達DLBCL 患者其OS 也比較差（P= 0.0325），提示DLBCL 患者UFC1 高表達者預后不良（圖5）。

圖5 OSdlbcl 分析顯示高表達UFC1 與DLBCL 預后不良相關，其PFS（A）、OS（B）均較短Fig.5 High expression of UFC1 indicate poor prognosis in patients with DLBCL according to OSdlbcl.Patients with high expression of UFC1 had shorter PFS（A）and OS（B）

2.5 UFC1共表達基因分析Linkedomics分析顯示，1 779個基因（暗紅點）與UFC1呈正相關，2 478個基因（暗綠點）與UFC1 呈負相關（false discovery rate，FDR ＜0.01，圖6A）。與UFC1正相關和負相關的前50個顯著基因熱圖顯示（圖6B、C）。UFC1共表達基因GO（Gene Ontology，GO）分析（圖6D）顯示主要涉及內質網蛋白定位、核糖體基因表達、線粒體呼吸鏈復合體、NADH 脫氫酶復合體翻譯啟動及翻譯延伸、細胞膜蛋白定位等；KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析顯示（圖6E）其主要富集在核糖體、氧化磷酸化、蛋白酶體、及癌癥miRNA、Hedgehog信號通路、JAK-STAT信號通路等。

圖6 DLBCL 中的UFC1 共表達基因分析結果Fig.6 UFC1 co-expression gene analysis in DLBCL

2.6 UFC1蛋白互作分析String數據庫檢索UFC1的PPI 分析結果（富集系數為0.803；P值為8.22 ×10-15）顯示（圖7）：與UFC1 相互作用密切的包括：PCMT1、COX17、UFSP1、UFSP2、USP34、USP9X、YKT6、SPR、TYMS、UBA3、UBA5、UFL1、ATP6V1B2等。

3 討論

DLBCL 是NHL 中最常見的類型，聯合免疫化療明顯提高了DLBCL 患者的生存預后，但仍然有相當一部分患者疾病復發。泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）介導細胞內泛素化的蛋白質經蛋白酶體降解，可高效并高選擇性地降解細胞內蛋白質，如細胞周期調節蛋白、癌基因和抑癌基因產物等，與血液系統惡性腫瘤的發生、發展密切相關［13］；如UBCH10 在霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B 細胞淋巴瘤、外周T 細胞淋巴瘤及伯基特淋巴瘤中均過度表達［14］。自1975年發現泛素和20 世紀80年代初發現泛素級聯以來，許多泛素樣蛋白（UBLs）被鑒定為翻譯后修飾因子，目前已經鑒定出17 種9 大類的類泛素蛋白：包括NEDD8、SUMO、ISG15、FUB1、FAT10、Atg8、Atg12、Urm1 和UFM1 等；研究顯示類泛素蛋白Atg8（或LC3）與介導細胞自噬相關，涉及Atg7、Atg3、Atg12/5/16L、Atg4A 等，研究顯示LC3 與Atg5 相互協同促進胃癌發生發展［15］，而Atg4A 的過表達促進胃癌細胞的EMT 作用，增強胃癌細胞的侵襲和轉移［16］；而以NEDD88 為靶點的酶抑制劑Pevonedistat 在淋巴瘤細胞中具有抗腫瘤活性，臨床研究也提示其在復發難治淋巴瘤治療有效［17］。

UFC1 定位于1 號染色體，為新鑒定的類泛素結合酶E2，屬于類泛素Ufm1 修飾系統（ubiquitinfold modifier 1，Ufm1）。研究發現UFC1 在乳腺癌組織和細胞系中高表達［18］，而沉默UFC1 抑制了乳腺癌細胞的多種生物學活性，UFC1 可以通過miR-34a/CXCL10 軸調控乳腺癌的生物學活性［19］。提示UFC1 基因與惡性腫瘤的發生和發展有著密切關系。

本研究首先通過IHC 檢測顯示UFC1 蛋白在DLBCL 中表達明顯高于反應性淋巴結炎（P＜0.001）；進一步的GEO 數據驗證發現UFC1 不僅在DLBCL 患者中表達明顯升高，同時在其他惡性淋巴瘤包括BL、MZL、MCL 及CLL 中均呈明顯高表達。

圖7 UFC1 蛋白互作網絡Fig.7 UFC1 protein interaction network

進一步的GEO 數據分析發現UFC1 表達與DLBCL 患者年齡和Hans 分型相關，在老年患者和non-GCB 類型的DLBCL 中表達更高，而與DLBCL患者的性別、結外浸潤、臨床分期、ECOG 評分及LDH 表達未發現明顯相關性。而已有的研究已經明確老年的DLBCL 患者和non-GCB 類型患者預后均相對不佳，推測UFC1 的異常表達可能與DLBCL患者預后相關。通過GEO 數據集GSE10846 分析證實UFC1 的表達與DLBCL 患者預后是相關的，UFC1 高表達患者的OS 明顯差于UFC1 低表達患者（P= 0.0326）；而OSdlbcl 數據庫檢索分析也證實了UFC1 高表達的DLBCL 患者PFS（P=0.0159）、OS（P=0.0325）均明顯差于UFC1 低表達患者，提示高表達UFC1 的DLBCL 患者預后不良。

UFC1 共表達基因富集分析結果與核糖體、氧化磷酸化及多種腫瘤癌癥通路相關，而研究顯示核糖體、氧化磷酸化等與腫瘤發生、發展密切相關，均可能為新的腫瘤治療潛在靶點［20-21］。UFC1蛋白互作分析顯示其與其與多種腫瘤標志物密切相關，包括PCMT1、COX17、UFSP1、UFSP2、USP34、USP9X、DDRGK1、YKT6、SPR、TYMS、UBA3、UBA5、UFL1、ATP6V1B2 等，而已有研究顯示PCMT1、USP9X、UBA5、DDRGK1 等［22-25］與腫瘤發生、發展明顯相關，是腫瘤的潛在治療靶點。

根據以上研究分析結果，UFC1 在DLBCL 淋巴瘤中表達異常增高，在老年患者和non-GCB 患者中表達升高明顯，高表達UFC1 的DLBCL 患者預后不良，UFC1 與多種腫瘤相關基因及腫瘤通路密切相關，有可能成為淋巴瘤的潛在治療靶點。