紅景天苷預處理脂肪干細胞促進糖尿病大鼠皮膚創面愈合的作用及機制

楊金龍 張榮明 魏巍 湯鋒 陳健

1錦州醫科大學附屬第一醫院燒傷整形小兒外科（遼寧錦州121000）；2遼寧省錦州市中心醫院整形外科（遼寧錦州121000）；3中國人民解放軍第968 醫院燒傷整形科（遼寧錦州121000）

糖尿病皮膚潰瘍是常見的糖尿病并發癥之一， 近些年干細胞移植用于該病的治療價值受到越來越多關注。但是，高糖環境對干細胞的增殖、遷移及分化具有抑制作用，不利于干細胞向糖尿病潰瘍創面的定向移動，進而影響了創面修復的效果［1-3］。紅景天苷是藏藥紅景天中的活性成分，有研究報道紅景天苷在干細胞的增殖、遷移、分化中起到調控作用［4-7］。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是組織工程領域重要的種子細胞之一，具有來源廣泛、取材方便等優勢，被用于燒傷創面、糖尿病皮膚潰瘍創面的治療［8-10］。本研究將紅景天苷用于ADSCs的干預，一方面觀察紅景天苷在高糖環境下對ADSCs 增殖、遷移及分化的影響，另一方面觀察紅景天苷處理ADCSs 后對糖尿病大鼠皮膚創面的愈合作用，旨在為今后使用ADSCs治療糖尿病皮膚潰瘍提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物7 ～8 周齡的SPF 級雄性SD 大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，體質量200 ～250 g，許可證號：SCXK（滬）2018-0004。

1.1.2 試劑紅景天苷、鏈脲佐菌素購自Sigma 公司，MTS 細胞增殖活力檢測試劑盒購自Promega 公司，結晶紫購自上海生工公司，RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，HE 染色試劑盒購自上海歌凡生物，CD44、CD29、CD45、CD34、角蛋白19（Cytokerantin19，CK19）、CD31、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、膠原蛋白（Collagen，Col）-Ⅰ、Col-Ⅲ抗體購自Abcam公司。

1.1.3 儀器細胞培養箱購自Thermo 公司，顯微鏡購自Nikon 公司，酶標儀購自Bio-tek 公司，凝膠成像系統購自上海天能公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ADSCs 的分離及驗證分離大鼠大腿內側腹股溝處的脂肪組織，剔除脂肪組織膜及血管后剪碎，消化酶消化組織后離心得到沉淀，重懸并接種在培養瓶中，24 h 后換液、去除未貼壁的細胞，而后每3 天換液1 次，細胞融合至80% ～90%后進行消化，取第三代細胞，在流式細胞儀上檢測CD44、CD29、CD45、CD34 的表達。

1.2.2 ADSCs 的分組及給藥第3 代ADSCs 隨機分為對照組、高糖組、高糖+紅景天苷組、紅景天苷組，分別用低糖（5.5 mmol/L）DMEM、高糖DMEM（25.0 mmol/L）、含有100 μg/mL 紅景天苷的高糖DMEM、100 μg/mL 紅景天苷的低糖DMEM 處理，每組設置4 個復孔。

1.2.3 ADSCs 增殖的檢測采用MTS 試劑盒檢測細胞活力并在酶標儀上檢測490 nm 波長處的吸光值A490。

1.2.4 ADSCs 遷移的檢測在Transwell 模型中檢測細胞遷移，ADSCs 接種在上層小室內，下層小室內加入含血清培養基，分組干預后2 d 用結晶紫對遷移細胞進行染色，而后在顯微鏡下觀察計數。

1.2.5 動物分組、造模及干預實驗動物隨機分為模型組、ADSCs 組、紅景天苷ADSCs 組，每組各8 只。造模方法如下：高脂高糖飼料喂養1 個月、腹腔注射鏈脲佐菌素誘導糖尿病，在背部正中做一直徑2 cm 創面。造模后6 h 開始進行干預，對照組經尾靜脈注入1 mL 培養基，ADSCs 組經尾靜脈注入1 mL 含有2 × 106個ADSCs 的培養基，紅景天苷ADSCs 組 經尾靜脈注入1 mL 含 有2 × 106個紅景天苷預處理48 h 的ADSCs 的培養基。

1.2.6 創面愈合的大體觀察干預前、及干預后第7 天、第14 天時，觀察創面并拍照，計算創面面積及愈合率。

1.2.7 創面愈合的形態學觀察干預后第14 天，處死大鼠并收集創面組織，4%多聚甲醛固定后制作切片，采用HE 染色試劑盒進行染色并在顯微鏡下觀察形態學改變。

1.2.8 蛋白表達的Western blot檢測取分組給藥的ADSCs或干預后第14天的大鼠創面組織，用RIPA裂解液提取蛋白并檢測蛋白含量，取含有30 μg 蛋白的樣本進行Western blot 檢測，電泳、電轉PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉、孵育一抗、二抗后在凝膠成像系統中顯影得到蛋白條帶，根據灰度值計算表達量。

1.3 統計學方法采用SPSS 20.0軟件錄入數據，計量資料采用均數±標準差表示，采用單因素方差分析進行差異性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADSCs 表面干細胞標志物的表達第三代ADSCs 表面CD44、CD29 的陽性率均在95%以上，CD45、CD34 陰性表達，表明ADSCs 符合間充質來源干細胞的特性。見圖1。

2.2 紅景天苷促進ADSCs 的增殖與對照組比較，高糖組的A490水平明顯降低，紅景天苷組的A490水平明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的A490水平明顯增加（P＜0.05）且在干預的第1 天、第2 天，紅景天苷組及高糖+紅景天苷組的A490水平逐步增加，而從干預的第3 天起、紅景天苷組及高糖+紅景天苷組的A490水平不再繼續增加，因此后續選擇紅景天苷干預2 d 作為檢測ADSCs 遷移、分化的時間點。見圖2。

2.3 紅景天苷促進ADSCs 的遷移干預后2 d，對照組、高糖組、高糖+紅景天苷組、紅景天苷組的遷移數目分別為（22.38±6.86）、（11.75±3.47）、（19.75±5.14）、（37.49±9.39）。與對照組比較，高糖組的遷移細胞數目明顯減少，紅景天苷組的遷移細胞數目明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的遷移細胞數目明顯增加（P＜0.05）。見圖3。

圖1 ADSCs 表面CD44、CD29、CD45、CD34 的表達Fig.1 Expression of CD44，CD29，CD45 and CD34 on ADSCs

圖2 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 增殖的影響Fig.2 Effect of salidroside on the proliferation of ADSCs under high glucose condition

2.4 紅景天苷促進ADSCs 的定向分化干預后2天，與對照組比較，高糖組的CK19、CD31、α-SMA表達量明顯減少，紅景天苷組的CK19、CD31、α-SMA 表達量明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的CK19、CD31、α-SMA 表達量明顯增加（P＜0.05）。見圖4、表1。

圖3 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 遷移的影響Fig.3 Effect of salidroside on the migration of ADSCs under high glucose condition

圖4 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Fig.4 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition

2.5 紅景天苷預處理ADSCs 移植促進糖尿病大鼠皮膚創面愈合的大體觀察及形態學觀察與模型組比較，ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組的創面愈合率均增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組的創面愈合率高于ADSCs 組（P＜0.05），見表2；HE染色觀察形態學改變顯示，模型組創面組織中存在大量淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞，新生血管及成纖維細胞減少；ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs組創面組織中成纖維細胞增多、炎癥細胞減少且紅景天苷+ADSCs 組的變化較ADSCs 組更明顯，見圖5。

表1 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Tab.1 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition ±s

表1 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Tab.1 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與高糖組比較，#P ＜0.05

組別對照組高糖組高糖+紅景天苷組紅景天苷組例數4 4 4 4 CK19 0.78±0.16 0.40±0.09*0.89±0.14*1.19±0.24#CD31 0.69±0.08 0.31±0.07*0.60±0.07*0.93±0.18#α-SMA 0.52±0.09 0.24±0.07*0.58±0.10*0.79±0.14#

表2 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創面愈合率的影響Tab.2 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on skin wound healing rate in diabetic rats x±s

2.6 紅景天苷預處理ADSCs增加糖尿病大鼠皮膚創面中膠原的表達量與模型組比較ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組皮膚創面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達量明顯增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組皮膚創面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達量明顯高于ADSCs組（P＜0.05）。見圖6、表3。

2.7 紅景天苷預處理ADSCs增加糖尿病大鼠皮膚創面中CK19、CD31、α-SMA 的表達量與模型組比較，ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組皮膚創面中CK19、CD31、α-SMA 的表達量明顯增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組皮膚創面中CK19、CD31、α-SMA 的表達量明顯高于ADSCs 組（P＜0.05）。見圖7、表4。

3 討論

ADSCs 是創面修復常用的一類干細胞［11-12］，多項研究報道，高糖環境顯著抑制ADSCs 的增殖、遷移及分化［13-16］。本研究分離ADSCs 并用高糖培養基處理，結果發現細胞的增殖、遷移受抑制，表皮、血管內皮、血管平滑肌的標志基因CK19、CD31、α-SMA 表達降低，表明高糖對ADSCs 的增殖、遷移及分化具有抑制作用，與既往其他學者的研究結果吻合。

圖5 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創面形態學的影響（HE 染色，×400）Fig.5 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on skin wound morphology in diabetic rats（HE staining，×400）

圖6 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達的影響Fig.6 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on Col-Ⅰ，Col-Ⅲexpression in skin wound in diabetic rats

圖7 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創面中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Fig.7 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on CK19，CD31，α-SMA expression in skin wound in diabetic rats

表3 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達的影響Tab.3 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on Col-Ⅰ，Col-Ⅲexpression in skin wound in diabetic rats x±s

ADSCs 在高糖環境下的上述變化會直接影響其修復糖尿病潰瘍創面的作用，需要進行必要的干預。國內學者的研究使用白細胞介素8、趨化因子-8 進行干預后，能夠減輕高糖引起的ADSCs 損傷［13-14］；國外學者的研究使用HIF-1α、CDC42 基因修飾的方式減輕了高糖引起的ADSCs 損傷［15-16］。紅景天苷是藏藥紅景天的活性成分，對高糖引起的多種細胞損傷具有保護作用［17-19］。本實驗在高糖環境下加用紅景天苷對ADSCs 進行處理，結果發現紅景天苷能夠減輕高糖對ADSCs 增殖、遷移、分化的抑制作用。

表4 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創面中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Fig.4 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on CK19，CD31，α-SMA expression in skin wound in diabetic rats±s

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與ADSCs 組比較，#P ＜0.05

組別 例數CK19CD31α-SMA模型組ADSCs 組紅景天苷ADSCs 組8 8 8 0.40±0.09 0.67±0.13*0.93±0.17#0.35±0.07 0.70±0.12*1.04±0.20#0.24±0.05 0.56±0.09*0.94±0.18#

干細胞在創面內的歸巢并向上皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞分化能夠促進創面的修復［20-22］。本實驗在建立糖尿病大鼠皮膚創面的模型后進行了ADSCs 的移植，單純移植ADSCs 能夠促進創面愈合、增加創面中的血管內皮細胞及成纖維細胞，而移植紅景天苷預處理的ADSCs 能夠增強上述促愈合作用，且創面中CK19、CD31、α-SMA 的表達均增加。這一結果表明紅景天苷預處理的ADSCs 具有更強的創面修復能力，紅景天苷可能通過促進ADSCs 增殖、遷移及分化的方式增強ADSCs 的創面修復能力。

綜上所述，紅景天苷對ADSCs 的增殖、遷移、分化具有促進作用，移植紅景天苷預處理的ADSCs 能夠促進糖尿病大鼠皮膚創面的愈合，促進ADSCs 增殖、遷移及其向表皮、血管內皮及血管平滑肌分化是可能的分子機制。但是目前關于ADCSs進入體內后增殖、定向分化并分布至潰瘍的機制尚未明確，今后應通過更多的在體外動物實驗來闡明ADCSs 或其他干細胞進入體內后的增殖、分化、遷移過程及相關機制。