缺糖缺氧心肌細胞中miRNA-155對Notch信號通路及自噬和凋亡的影響

陳希妍 馬彥娟 牛麗丹 楊亞琴 楊飛云 石金河

新鄉醫學院第一附屬醫院急診科（河南衛輝453100）

miRNA 是一類長度為19～25 nt 的非編碼單鏈小分子RNA，在心臟重塑、血管細胞收縮、心肌收縮以及脂質代謝等心血管疾病中發揮重要的調控作用［1-2］。miRNA-155 與動脈粥樣硬化存在著密切關系［3］，并且其還參與心肌細胞損傷，下調miRNA-155 水平可減輕心肌細胞損傷程度［4］。以往的研究［5-6］顯示，Notch 信號通路參與缺氧/復氧所誘導的心肌細胞損傷，骨髓間充質干細胞條件培養液通過Notch2/mTOR/自噬信號途徑保護心肌細胞免受缺氧/復氧損傷［7］。miRNA-381 通過抑制Notch 信號通路負性調節心肌細胞存活［8］。研究顯示Notch 信號通過調節細胞自噬發揮細胞的保護作用［9］，而抑制miRNA-155 表達可通過上調自噬作用減輕氧化損傷，促進細胞增殖［10］。miRNA-155 是否是通過對Notch1 信號通路的影響而發揮細胞保護作用，還未見報道。本研究以H9C2 細胞為研究對象，建立缺糖缺氧細胞模型，檢測miRNA-155 與Notch1 信號通路及細胞自噬，凋亡的關系，將為臨床心肌細胞缺血、缺氧的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞大鼠心肌細胞H9C2 細胞株購自于協和細胞庫

1.2 主要試劑miRNA-155 inhibitor、轉染試劑體LipofectamineTM2000，購自于蘇州吉瑪基因公司。Notch1 抗體，HES1 抗體購自于SANTA Cruz 公司，Beclin1 抗體，cleaved-Caspase-3 抗體購自于Abcam公司，GAPDH 抗體購自于Sigma 公司

1.3 心肌細胞的培養H9C2 細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基中（含100 U/mL 青霉素及0.1 mg/mL 鏈霉素），置于37 ℃、5 % CO2的恒溫培養箱中，2～3 d 傳代1 次，實驗所用細胞均為對數生長期細胞。

1.4 缺氧缺糖細胞模型的建立及實驗細胞分組將H9C2細胞正常培養（37 ℃、5%CO2的恒溫培養）24 h后，更換成不含血清的低糖DMEM 培養基低氧條件下（1%O2、95%N2、5%CO2）培養24 h。正常對照組，缺氧缺糖組（OGD group），缺氧缺糖+陰性對照miRNA-155 inhibitor 組（轉染陰性對照miRNA-155 inhibitor 后缺氧缺糖條件培養24 h）（OGD +miRNA-155 inhibitor negative control group），缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 組（轉染miRNA-155 inhibitor 后缺氧缺糖條件培養24 h）（OGD + miRNA-155 inhibitor group）。

1.5 RT-qPCR 檢測miRNA-155 mRNA 的表達分別提取正常對照組與OGD 組心肌細胞總RNA，利用RT-qPCR 檢測兩組細胞中miRNA-155 mRNA的表達變化，（miRNA-155-F CGCGTTAATGCTAATCGTGAT；miRNA-155-R CGCGTTAATGCTAATCGTGAT），按照逆轉錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA 為模板進行擴增，RT-qPCR 反應條件：預變性94 ℃30 s，變性94 ℃5 s、退火56 ℃30 s、延伸72 ℃30 s，共40 個循環。

1.6 心肌細胞轉染按照轉染試劑的使用說明，利用轉染試劑分別將miRNA-155 inhibitor ，陰性對照miRNA-155 轉染至H9C2 細胞中。

1.7 Western blot 檢測細胞中Notch1，HES1 及Beclin1，cleaved-Caspase-3的表達變化收集正常對照組，缺氧缺糖組（OGD group），缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 陰性對照組與缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 組細胞，利用RIPA 裂解液裂解細胞，提取總蛋白。常規SDS-PAGE 電泳、轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Notch1 抗體（1∶500），HES1 抗體（1∶500），Beclin1抗體（1∶500），cleaved-Caspase-3 抗體（1∶1 000）及GAPDH 抗體（1∶10 000）4 ℃孵育過夜，熒光Ⅱ抗（1∶1 000）室溫孵育2 h 后，Odyssey 曝光，Image J 軟件分析灰度值。

1.8 心肌細胞活性的檢測將H9C2 按照5 × 103的密度接種于96 孔板中，按照上述方法將細胞分為4 組，在缺氧缺糖誘導24 h 后檢測各組活性，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，正常培養條件下繼續孵育3 h，酶標儀450 nm 處測OD值。

1.9 統計學方法利用SPSS 17.0 軟件進行數據分析處理，實驗數據以均數±標準差表示，兩樣本數據比較采用t檢驗，多樣本數據比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 正常對照組與OGD組心肌細胞中miRNA-155 mRNA 的表達變化利用RT-qPCR 檢測了2 組細胞中miRNA-155 mRNA 的表達情況，結果如圖1 所示，與正常組相比較，OGD 組心肌細胞中miRNA-155 mRNA 的表達顯著升高（P＜0.01）。

圖1 利用RT-qPCR 檢測miRNA-155 mRNA 在2 組細胞中的表達Fig.1 The expression of miRNA-155 mRNA in two groups was detected by RT-qPCR

2.2 Notch1、HES1、Beclin1、Caspase-3 在各組細胞中的表達情況利用Western blot 檢測了正常對照組、OGD 組、OGD+miRNA-155inhibitor 陰性對照組及OGD + miRNA-155 inhibitor 組心肌細胞中Notch1、HES1、Beclin1、cleaved-Caspase-3 蛋白的表達情況（圖2），與正常對照組相比較，OGD 組心肌細胞中的Notch1、HES1 蛋白的表達顯著降低（P＜0.01），而Beclin1 與cleaved-Caspase-3 蛋白的表達顯著升高（P＜0.001）；與OGD 組相比較，轉染miRNA-155 inhibitor 后，心肌細胞中的Notch1，HES1 及Beclin1 蛋白的表達顯著升高（P＜0.05），而cleaved-Caspase-3 蛋白的表達顯著降低（P＜0.01）。提示miRNA-155 負向調節Notch1 信號通路的激活，促進細胞自噬，抑制細胞凋亡，從而發揮細胞保護作用。

圖2 Western blot 檢測Notch1、HES1、Beclin1、cleaved-Caspase-3 蛋白在4 組細胞中的表達Fig.2 The expression of Notch1，HES1，Beclin1and cleaved-Caspase-3 in four groups was detected by Western blot

2.3 CCK-8實驗檢測各組心肌細胞的活性CCK-8實驗結果顯示，與正常對照組相比較，OGD 組細胞的活性顯著降低（P＜0.01）；而與OGD 組相比較，轉染miRNA-155 inhibitor 后，細胞的活性則顯著升高（P＜0.05），miRNA-155 inhibitor 陰性對照組細胞的活性差別無統計學意義（P＞0.05，圖3），這就提示在缺氧缺糖情況下，抑制miRNA-155 后，通過促進Notch1 信號的激活，提高心肌細胞的活性。

3 討論

急性心肌梗死（acute myocardial infraction，AMI）是由于血栓或冠狀動脈粥樣硬化斑塊的急性改變引發冠狀動脈閉塞，導致心肌細胞嚴重缺血缺氧的心血管疾病［11］，嚴重威脅著人類的生命健康。microRNAs 是一類在許多生物學過程中是必不可少的非編碼的RNA，在細胞增殖、分化和凋亡過程中起著關鍵作用［12-14］。作為一種多功能的miRNA，miRNA-155 不僅在腫瘤的生長中發揮作用［15］，更有研究顯示其在心腦血管疾病中發揮重要作用［10］，miRNA-155 表達減弱可減輕氧化損傷，通過上調細胞自噬促進細胞增殖［10］。miRNA-155 異常表達對腦缺血產生顯著影響，其可通過Notch 信號通路對腦缺血再灌注損傷產生影響［16］，而其在心肌細胞的缺血缺氧損傷中的作用機制還不清楚。

圖3 各組心肌細胞的活性。Fig.3 The viability of cells in each group

本研究通過建立心肌細胞缺血缺氧模型，檢測miRNA-155 在心肌細胞中的表達變化，結果顯示，與正常對照組相比較，模型組細胞中miRNA-155 的表達顯著升高，差異有統計學意義。

越來越多的研究表明，Notch 信號通路心血管疾病中發揮著心肌細胞保護作用［17-18］，孔令宇等［9］的研究顯示，Notch 信號通過調節細胞自噬發揮細胞細胞的保護作用。本研究通過抑制miRNA-155的表達檢測缺糖缺氧的心肌細胞中Notch1、HES1、自噬相關蛋白Beclin1、Caspase-3 蛋白的表達，結果顯示，抑制miRNA-155 的表達后，缺糖缺氧的心肌細胞中Notch1，HES1，自噬相關蛋白Beclin1 的表達均顯著升高，而Caspase-3 蛋白的表達顯著下降；CCK-8 實驗結果顯示，與模型組相比較，抑制miRNA-155 的表達后，心肌細胞的活性顯著升高。

綜上所述，在缺血缺氧條件下，抑制miRNA-155 的表達可促進Notch 信號通路的激活，促進心肌細胞自噬，減少細胞凋亡，減輕心肌細胞的損傷，增強細胞活性，從而發揮對心肌細胞的保護作用。