利用單細胞技術探究腫瘤相關巨噬細胞的特征

代艷 包夢穎 曾燕玉 劉云 葉雨

1廣西醫科大學第二附屬醫院（南寧530007）；2廣西基因組與個體化醫學研究重點實驗室（南寧530022）；3廣西醫科大學第一附屬醫院骨科（南寧530021）

巨噬細胞在多種疾病的發病機制中扮演重要角色，既往研究表明它除了對病原體、慢性炎癥、纖維化和癌癥有防御作用，還具有調節造血微環境、影響機體代謝、介導組織修復和監視胚胎組織的成熟等非免疫作用［1］。巨噬細胞表型最初被劃分為M1 和M2，其中M1 抗炎及阻止腫瘤進展，而M2 發揮抗炎、組織重塑及免疫抑制，促進腫瘤的進展和侵襲［2］。近年來發現，有少數巨噬細胞表型并不歸屬于傳統的M1 或M2 類，在宿主免疫系統中也具有重要功能，包括：腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）、CD169+及TCR+巨噬細胞，它們分布位置不同，且在不同的疾病發生發展中具有各自的功能和特點［2］。TAMs主要是指浸潤在腫瘤組織或填充在實體腫瘤微環境（Tumor microenvironment，TME）中的巨噬細胞，在腫瘤中受高度關注。以往認為大部分TAMs 極化為M2 型［3］。最近的報道表明，區分經典極化的抗腫瘤M1 和交替極化的促腫瘤M2 亞型的模型并不能完全解釋體內的TAMs 表型多樣性［4］，TAM 的定義及其功能一直頗具爭議。單細胞技術可以從單個細胞層面研究TAMs 的可塑性及TAMs 與惡性細胞和腫瘤浸潤的T 細胞之間的交互作用，這將為探索潛在的以TAMs 為治療中心的免疫治療提供理論依據。

1 單細胞技術原理及其應用

目前常用的單細胞技術主要是質譜流式技術（mass cytometry by time-of-flight，CyTOF）和單細胞RNA 測序（single-cell mRNA sequencing，scRNAseq），見圖1。CyTOF 可同時檢測數百萬單個細胞中的40 多個蛋白標記物，既類似于低維流式細胞儀的經典分析方法，也類似于單細胞測序的高維方法，對于理解TME 復雜性有幫助［5］。scRNA-seq則提供無偏見的策略來描述單個細胞的轉錄組特征，基于不同平臺可有很多方法可供選擇，比如使用全長測序方法（如Smart-seq2）高敏感度可檢測到更多的基因數或3′端測序方法（如CEL-Seq2和MARS-seq）更少的放大噪音量化了mRNA 水平，以及基于drop 的方法（如Drop-seq、InDrop 和10×Chromium Genomics）［6-7］增加測序通量。單細胞測序技術已應用于胚胎發育、神經生物學、腫瘤、免疫、微生物、嵌合體分析等多個研究領域［8-9］，以及在多組學上探究單個腫瘤細胞的異質性和基因突變，還可用于臨床中腫瘤耐藥機制的研究，深入理解腫瘤發生、發展的過程［10］。目前利用單細胞技術探究巨噬細胞及其亞群標記物的文獻總結見表1。

2 CyTOF 技術對TAMs 的特征探索

腫瘤生態系統可受到細胞相互作用的影響，而針對促進腫瘤發展的細胞間作用的治療策略具有相當大的前景。很多研究是針對耗竭性T 細胞（Exhausted T cells，TEx）和調節性T 細胞（regulatory T cells ，Tregs）的免疫檢查點進行抑制［21］，而T 細胞的耗竭可被TAMs通過共刺激受體調節。在80%的腫瘤中，至少10%的髓系細胞為PD-L1+［22］，TAMs可以通過免疫抑制作用（如PD-L1 表達）來調節腫瘤生態系統［23］。

圖1 scRNA-seq 和CyTOF 技術的流程和分類Fig.1 Flow and classification of SCRNA-SEQ and CyTOF techniques

表1 基于單細胞技術定義的巨噬細胞亞群Tab.1 Macrophage cell subsets identified based on the integrated single-cell studies

LAVIN 等［14］通過CyTOF 技術繪制了早期肺腺癌TME 中免疫細胞的詳細圖譜，發現巨噬細胞主要在腫瘤侵襲邊緣聚集成致密簇，并且高表達PD-L1，有研究表明TME中PD-L1及TAMs的表達與非小細胞肺癌（NSCLC）患者的預后密切相關［24］。另一項對人腎臟透明細胞癌的研究發現所有TAMs 表達促腫瘤（CD206、CD204、CD163）和抗腫瘤（CD169）標記物［12］。有一群TAMs 表達CD38，具有編碼T 細胞衰竭的PD-1 的配體PDCD1LG2 和CD274 及吸引CD8+T 細胞和Treg 的趨化因子CCL8和CXCL10的免疫抑制特征，而另兩群TAMs雖與這類TAMs 共享大部分特征，但不表達CD38、無免疫抑制特征，說明CD38在調控T細胞活性中的重要作用。又一項對于人乳腺癌的研究也發現PD-L1+TAMs 的特征類似于腎癌，主要在3 級腫瘤中富集，進一步分析發現PD-L1+TAM 與Tregs 和PD-1highCTLA-4+CD38+TEx 表型相關，均表現出免疫抑制且相互作用［17］。HARTER 等［25］研究表明，PD-L1+TAM 的存在與Tregs 的比例有關，而Tregs 分泌的細胞因子如IL-10、IL-4 和IL-13，可能會觸發免疫抑制特性的TAMs 的發展［3］。綜上所述，TAMs 與Tregs 之間的細胞交互作用有希望成為治療方向。

3 利用scRNA-seq技術對TAMs特征的探索

最初，CHUNG 等［26］在原位乳腺癌中發現TAM主要以免疫抑制的M2 特征為主，這種TAM 通過促進血管生成和抑制免疫監視來促進腫瘤發展。最近有研究提出TAMs 可共表達M1 和M2 標志物，這一觀念的提出對傳統的M1 和M2 分類方式產生巨大的沖擊，傳統的分類方式已經無法體現巨噬細胞的異質性。

3.1 TAMs 還表現共表達M1 和M2 相關基因的特征TME 中的TAMs 具有廣泛異質性，MüLLER等［13］在神經膠質瘤中以嘌呤能受體（如P2RY12）標記小膠質細胞來源的TAMs，而以CD49D（由ITGA4 編碼）標記血源性TAMs，發現TAMs 共表達M1 和M2 基因，揭示了血源性TAMs 浸潤數量與低級別膠質瘤存活率呈顯著負相關，提出區分TAMs及針對免疫抑制血源性TAMs 的治療策略。AZIZI等［11］和LAMBRECHTS 等［27］在乳腺癌和肺癌也發現TAMs 相似的特征，并為連續表型，這挑戰了傳統的巨噬細胞的激活與極化模型，比M1 和M2 狀態共存的模型更進一步揭示這種共表達特征在很多腫瘤中是共存的。

3.2 10XGenomics 與Smart-seq2 結合分析腫瘤中TAMs 的特征一些學者將10XGenomics 與Smartseq2 方法結合多組織整合分析，既比較兩種方法的綜合分析能力，也從高分辨率角度了解腫瘤中TAMs 的表型及追蹤其在不同組織中的動態。ZHANG 等［19］發現主要富集于腫瘤組織的骨髓源性抑制細胞樣巨噬細胞和TAM 樣巨噬細胞，其中TAM 樣巨噬細胞表現為M1 和M2 特征共存，比經典的M1/M2 更加復雜。它表達的基因SLC40A1 和GPNMB 與預后不良有關，這種TAMs 可能是一種潛在的靶向治療癌癥的候選細胞。ZHANG 等［20］在結直腸癌（colorectal cancer，CRC）中鑒定了兩個不同的TAMs，包括C1QC+和SPP1+TAMs，這兩個種群都不符合M1 和M2 的二分體表型。SMILLIE 等［28］發現在潰瘍性結腸炎和健康個體的結腸黏膜中只有C1QC+TAMs，而促血管生成的SPP1+TAM 僅富集在CRC 患者癌組織中，提示其可能在CRC 發生發展中發揮重要作用。使用Anti-CSF1R 抑制劑只減少部分C1QC+TAM，保留了SPP1+TAMs，這可能是Anti-CSF1R 單藥治療腫瘤效果不佳的原因。綜上所述，個性化探索TAMs 在不同的腫瘤中特征和功能可為精準免疫治療提供線索。

4 單細胞技術與RNA 測序技術在研究TAMs 中的優勢

RNA 測序（RNA-seq）［29］是一種基因組方法，通常檢測成千上萬個混合細胞的總RNA 量來估計不同基因的表達水平，忽視了單個細胞間的異質性。而scRNA-seq 更關注細胞的異質性，無偏性分析可解決TAM的復雜性。CyTOF和scRNA-seq平臺是對正常和腫瘤樣本中復雜免疫系統的分析，這些研究開始系統地揭示不同比例和亞型的免疫細胞［30］，比如揭示NSCLC 組織中介導單核細胞向M2 分化的關鍵轉錄因子［31］。在腫瘤的不同分級和亞型中識別鑒定血液來源及組織駐留的巨噬細胞的標記，比較其標記物的差異表達，以便了解腫瘤中主導的免疫抑制類群以及設計更有效的精準治療方法［13］。許濤等［32］分析三陰性乳腺癌（TNBC）中巨噬細胞的關鍵標記基因，為TNBC 患者的靶向與免疫治療提供思路。scRNA-seq 和總RNA-seq聯合分析TNBC［33］，通過scRNA-seq 發現高比例的M2 樣TAMs。再采用bulk RNA-seq 分析TAMs 與生存之間的關系。采用多種生物信息學方法建立TAM 相關基因標記來預測生存和免疫治療反應，為開發新一代TNBC 的免疫療法和精準治療提供依據。研究組織中同類型細胞間的差異性，單細胞技術可能是更為合適的研究方式，但傳統的測序方法也有其價格及對樣本的要求低的優勢，需根據自身的研究需要合理選擇適合的研究方法。

5 單細胞技術的不足

CyTOF 依賴多種抗體，無法區分腫瘤組織、健康鄰近組織和血管特異性免疫細胞表型。scRNAseq 也存在限制和條件，首先是可能產生因實驗重復在不同時間或從不同平臺生成的數據等引起的批次效果［34］；其次是基于drop 的測序方法每個細胞只能捕獲小部分轉錄組；而且有時mRNA 與蛋白質的表達水平不一致。此外，組織消化會使細胞產生應激，改變某些基因的表達和細胞表面分子；組織樣本取材不同和解離過程，導致獲取的表達信息不能映射到解剖位置或者細胞結構。因此，單細胞技術需要克服它的局限性，將TME 的細胞、分子和結構信息結合展現。

6 總結與展望

本綜述討論了利用單細胞技術在不同腫瘤組織中對巨噬細胞群體的探究，更好地了解在不同腫瘤中巨噬細胞的表型和功能多樣性。它們與疾病、患者的臨床特征和未來事件的關系可能有助于理解疾病的發病機制及為腫瘤未來的靶向治療提供理論基礎。此外，在未來的人類腫瘤研究中，將轉錄組數據集與臨床數據關聯，包括病灶特征（如細胞含量及免疫細胞浸潤程度、浸潤部位）、腫瘤分期等，而且應進一步描述巨噬細胞亞群。應用本綜述中描述的不同組織中巨噬細胞類群及一系列標記物，未來CyTOF 實驗可能證實并詳細說明巨噬細胞群體在人腫瘤中的存在及功能。此外，亞群特異性標記也可以應用于區分群體的不同狀態和隨后具有詳細特征的細胞表型。未來可結合scATAC-seq（染色質開放區）和scCHIP-seq（特定組蛋白標記）對表觀基因組景觀進行研究，以進一步揭示特異巨噬細胞亞群及它們的調控途徑，如表觀遺傳過程和控制它們的轉錄因子。

總之，未來單細胞技術的方向將是單細胞多組學分析，可從同一個單細胞中獲得轉錄組、甲基化組和表觀基因組，分析細胞的異質性、疾病轉移的分子特征、細胞間的相互作用，比較不同疾病階段和治療前后免疫細胞亞群之間的基因表達和分化途徑的差異。此外，空間轉錄組學可還原單個細胞的解剖信息。因此，可以繪制腫瘤浸潤免疫細胞動態工作的圖譜，這將是改進免疫療法和支持新療法發展的第一步，將為加速這一方向的研究提供有價值的資源。