PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者外周血T細胞亞型和CD4+CD25+調節性T細胞研究

胡偉嬌 婁江濤 周俊 殷一紅

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種病因復雜，影響人體生殖、內分泌等多系統的異質性疾病，在青春期及育齡期婦女中發病率達5%～10%[1]。PCOS病因復雜，至今仍不明確，但患者血清中常有多種自身抗體存在，提示自身免疫反應可能是PCOS發病的一個因素。研究發現，甲狀腺過氧化物酶抗體（antithyroid peroxidase autoantibody，TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（anti-thyroglobulin antibody，TGAb）在PCOS患者血清中顯著升高[2-3]。這些抗體是診斷自身免疫性甲狀腺炎的特異性抗體，長期存在最終可導致甲狀腺功能受損，而甲狀腺功能異常會影響女性垂體性腺軸及卵巢功能，加重PCOS的病情。T細胞亞群的正常分布對維持機體穩態有重要意義，T細胞亞群失衡與多種自身免疫性疾病有關[4-5]。另外，CD4+CD25+調節性T細胞數量與功能降低亦是造成自身免疫性疾病發生的重要原因[6]。基于此，本研究擬通過觀察PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者外周血T細胞亞群分布情況和CD4+CD25+調節性T細胞數量與功能，探討外周血T細胞亞群及CD4+CD25+調節性T細胞在PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者發病中的作用，以期為其臨床診治提供參考，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年3月至2018年12月寧波市中醫院婦科就診的PCOS和PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者各50例。PCOS診斷標準[7]：（1）稀發排卵或無排卵；（2）高雄激素的臨床體征和（或）生化證據；（3）多囊卵巢。其中稀發排卵指月經周期≥35 d或每年月經次數＜9次；無排卵指月經周期超過3個月、閉經或功能失調性子宮出血病；多囊卵巢指超聲檢查單側或雙側卵巢內可見直徑2～9 mm的卵泡≥12個和（或）卵巢體積＞10 ml。上述3項有任意2項即可診斷。同時PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者需同時滿足 TPOAb＞9.0 U/ml和（或）TGAb＞4.0 U/ml且甲狀腺功能無異常。所有患者均為初診，未經治療，并除外先天性腎上腺皮質增生癥、庫欣綜合征、分泌雄激素的腫瘤等可導致高雄激素血癥的原因。另擇同期來本院進行健康體檢的已婚健康女性50例為正常對照組，及體檢TPOAb＞9.0 U/ml和（或）TGAb＞4.0 U/ml且甲狀腺功能及其它癥狀體征無異常者50例為單純甲狀腺抗體陽性組。PCOS組[（29.95±4.60）歲]、PCOS合并甲狀腺抗體陽性組[（31.31±4.30）歲]、甲狀腺抗體陽性組[（31.37±6.20）歲]及正常對照組[（30.67±4.20）歲]年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 全自動免疫發光分析儀DXI-800型及配套試劑和全自動生化分析儀AU5821型及配套試劑均購自美國BACKMAN公司。全自動糞便分析儀AVE-562及配套試劑均購自長沙愛威科技有限公司。熒光定量PCR儀Mx3000P型購自美國Stratagene公司，普通PCR儀購自德國Roche公司，總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及RT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。流式細胞儀Navios型，熒光抗體CD3-PC5、CD4-RD1、CD8-ECD 和 CD25-PE 均購自美國BACKMAN公司。

1.2.2 標本采集 所有受試者均在月經周期的第3～5天時抽取空腹肘靜脈血5 ml，分離血清后測定性激素、胰島素和葡萄糖；同時抽取EDTA抗凝血5 ml，其中1 ml用于流式細胞術檢測，其余4 ml采用Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個核細胞，用于總RNA的提取。

1.2.3 BMI測算 測量身高和體重，BMI在18.5～22.9為正常體重，BMI≥23.0為超重，BMI＞25.0為肥胖。

1.2.4 胰島素抵抗指數（homeostasism odela ssessment of insulin resistance，HOMA-IR）測算 通過穩態模型法計算 HOMA-IR，HOMA-IR=[空腹胰島素（mU/L）×空腹血糖（mmol/L）]/22.5。HOMA-IR ≥2.69判定為胰島素抵抗。葡萄糖及胰島素分別采用全自動生化分析儀和免疫發光儀及配套試劑盒測定。

1.2.5 生殖內分泌激素、甲狀腺特異性抗體及血糖測定 采用全自動免疫發光儀及配套試劑盒測定卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、促黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）、睪酮（yestosterone，T）、TPOAb和 TGAb。

1.2.6 糞便球桿菌比測算 采用全自動糞便分析儀檢測糞便球菌和桿菌，并計算其比值。

1.2.7 T細胞亞群檢測 取EDTA抗凝外周血0.5 ml，加入CD3-PC5、CD4-RD1、CD8-ECD和 CD25-PE各5 μl，室溫避光孵育15 min，置溶血儀中溶血，然后加入2 ml PBS洗滌離心后棄上清液。用500 μl PBS重懸細胞，利用流式細胞儀檢測分析T細胞亞群。

1.2.8 IFN-γ、IL-4和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子（fork head box protein p3，Foxp3）mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。外周血單個核細胞總RNA提取采用Trizol法，具體按照試劑盒說明書操作。提取的總RNA經DU800紫外分光光度計測定A260/A280比值在1.8～2.0用于后續試驗。逆轉錄操作嚴格按試劑盒說明書進行。所需引物均由上海生工生物工程公司設計并合成，序列見表1。20 μl PCR反應體系中含有上游引物900 nmol/L，下游引物 300 nmol/L，cDNA 2 μl，Universal Master Mix 10 μl。擴增條件：94℃預變性2 min，再用二步法進行擴增：94℃ 10s，60℃ 30 s，共反應40個循環。計算目的基因 mRNA 相對表達量，計算公式為 2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。Foxp3 mRNA表達水平與各指標的相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組受試者 BMI、HOMA-IR、LH/FSH、T、糞便球桿菌比、TPOAb、TGAb比較 與正常對照組相比，甲狀腺抗體陽性組患者除糞便球桿菌比、TPOAb和TGAb有所升高（均P＜0.05）外，其余各指標比較均無統計學差異（均P＞0.05）；PCOS組及PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者 BMI、HOMA-IR、LH/FSH、T 及糞便球桿菌比均升高（均P＜0.05）。與甲狀腺抗體陽性組相比，PCOS組及PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者BMI、HOMAIR、LH/FSH 及 T均升高（均 P＜0.05），而 PCOS組糞便球桿菌比降低（P＜0.05）。PCOS合并甲狀腺抗體陽性組與甲狀腺陽性組在糞便球桿菌比、TPOAb及TGAb比較均無統計學差異（均P＞0.05）。與PCOS組相比，PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者除T無統計學差異（P＞0.05） 外，BMI、HOMA-IR、LH/FSH 及球桿菌比均升高（均P＜0.05）。見表2。

表2 4 組受試者 BMI、HOMA-IR、LH/FSH、T、糞便球桿菌比、TPOAb、TGAb 比較

2.2 4組受試者外周血T細胞亞群比較 與正常對照組相比，PCOS組、PCOS合并甲狀腺抗體陽性組和甲狀腺抗體陽性組患者的CD4+T細胞比例及CD4+T細胞/CD8+T細胞比值均升高（均P＜0.05），CD8+T細胞比例降低（均P＜0.05）。與甲狀腺抗體陽性組相比，PCOS患者組CD4+T細胞比例、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值及CD8+T細胞比例均無統計學差異（均P＞0.05），而PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者CD4+T細胞比例、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值均升高（均P＜0.05），而CD8+T細胞比例有所降低（P＜0.05）。另外與正常對照組相比，PCOS組、甲狀腺抗體陽性組和PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者的CD4+CD25+調節性T細胞比例均降低（均P＜0.05），同時與PCOS組患者相比，甲狀腺抗體陽性組和PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者CD4+CD25+調節性T細胞比例降低更為明顯（均P＜0.05），而甲狀腺抗體陽性組和PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者CD4+CD25+調節性T細胞比例比較無統計學差異（P＞0.05）。見表3。

表3 4組受試者外周血T細胞亞群比較

2.3 4組受試者外周血IFN-γ、IL-4和Foxp3 mRNA表達水平比較 與正常對照組相比，甲狀腺抗體陽性組、PCOS組及PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者IFN-γ mRNA和Foxp3 mRNA表達均下調（均P＜0.05），IL-4 mRNA表達均上調（均P＜0.05）。與PCOS組相比，PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者IFN-γ mRNA和Foxp3 mRNA表達下調（均P＜0.05），IL-4 mRNA表達上調（P＜0.05）。見表4。

表4 4組受試者外周血IFN-γ、IL-4和Foxp3 mRNA表達水平比較

2.4 PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者Foxp3 mRNA表達水平與各指標的相關性 PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者 Foxp3 mRNA 表達水平與 HOMA-IR、BMI、LH/FSH、CD4+T 細胞/CD8+T 細胞、IL-4 mRNA、TPOAb、TGAb和糞便球桿菌比均呈負相關（均P＜0.05），而與IFN-γ 呈正相關（P＜0.05），見表5。

表5 PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者Foxp3 mRNA表達水平與各指標的相關性

3 討論

PCOS是育齡期婦女常見的一種內分泌代謝異常性疾病，典型臨床表現為月經異常、高雄激素以及卵巢多囊性改變等，同時多數伴隨以胰島素抵抗為核心的代謝綜合征。其發病原因涉及遺傳、心理、代謝、免疫等多種因素。由于PCOS患者血清中常可檢測出多種自身抗體，如組織特異性抗體TGAb、TPOAb和促甲狀腺激素受體抗體，以及組織非特異性如抗核抗體、抗Sm抗體、抗組蛋白抗體等。因此目前有不少觀點認為，PCOS是一種自身免疫性疾病，與自身免疫狀態密切相關但機制尚未明確。正常免疫應答過程依賴于各種免疫細胞，特別是各T細胞亞群之間的相互協調和相互制約，外周血中的T細胞分為CD4+和CD8+兩個主要亞群。CD4+T細胞為Th，可分化為不同的亞型，調節不同的免疫反應類型。CD8+T細胞稱為細胞毒性T細胞，對主要組織相容性復合體Ⅰ（MHCⅠ）類抗原的靶細胞產生細胞毒等作用。正常情況下CD4+T細胞和CD8+T細胞的數量和比例是反映細胞免疫平衡與否的敏感指標[8]。本研究應用流式細胞術分析了外周血T細胞分化情況，結果顯示甲狀腺抗體陽性組、PCOS組和PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者外周血CD4+T細胞比例及CD4+T細胞/CD8+T細胞較正常對照組顯著升高；同時，PCOS合并甲狀腺抗體陽性組較PCOS組患者外周血CD4+T細胞比例及CD4+T細胞/CD8+T細胞升高，提示PCOS組和PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者存在Th異常升高為主的淋巴細胞亞群失調。另外，與甲狀腺抗體陽性組相比，PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者CD4+T細胞比例、CD4+T細胞/CD8+T細胞均明顯增高，而CD8+T細胞比例亦明顯降低。提示PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者淋巴細胞亞群失調更為顯著。

Th在維持機體穩態方面發揮著重要的作用，其激活后主要分為Th1和Th2，分別在細胞免疫和體液免疫應答中發揮重要作用。正常情況下，Th1/Th2因子呈動態平衡，而平衡遭到破壞常預示著免疫功能紊亂，研究表明多種自身免疫疾病都涉及到Th1/Th2失衡狀態[9-10]。Th1 主要分泌 IL-2、IL-12、IL-15、TNF-α 和 IFN-γ 等，而 Th2 主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-13等。本研究通過觀察Th1和Th2的效應細胞因子IFN-γ和IL-4在基因轉錄水平的表達情況來分析其在PCOS和PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者機體中的狀態。結果顯示，PCOS患者IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA表達與正常對照組相比均明顯上調，而PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者IFN-γ mRNA表達較正常對照組明顯下調，相反，IL-4 mRNA表達明顯上調。同時與甲狀腺陽性組相比，PCOS合并甲狀腺抗體組患者IFN-γ mRNA表達較正常對照組下調更為明顯。相反，IL-4 mRNA表達上調亦更加明顯，提示甲狀腺抗體陽性患者、PCOS患者及PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者機體均存在Th向Th2向分化偏移現象，而PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者偏移更為嚴重。

CD4+CD25+調節性T細胞是目前研究較多的CD4+T細胞亞型，是正常人和動物T細胞庫的一個組成部分，具有抑制自身反應性T細胞的功能，在自身免疫耐受中起重要作用[11]。研究顯示，正常小鼠去除CD4+CD25+調節性T細胞后可引起多種自身免疫性疾病如睪丸炎、卵巢炎、炎性腸病、1型糖尿病及甲狀腺炎等，而移植CD4+CD25+調節性T細胞能有效預防這些疾病的發生[12-13]。轉錄因子Foxp3是叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子家族成員之一，特異地表達于CD4+CD25+調節性T細胞，并對該型細胞的發育和功能狀態起關鍵作用[14-15]。本研究結果顯示，與正常對照組相比，甲狀腺抗體陽性組、PCOS組和PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞比例和Foxp3 mRNA表達水平均降低；與甲狀腺抗體陽性組相比，PCOS合并甲狀腺抗體陽性組患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞比例和Fopx3 mRNA表達降低更為明顯，提示外周血CD4+CD25+調節性T細胞數量和功能降低可能是PCOS患者易合并發生自身免疫性疾病的原因之一。同時通過相關性分析發現，Foxp3 mRNA 與 HOMA-IR、BMI、LH/FSH、CD4/CD8、IL-4、TPOAb、TGAb和糞便球桿菌比均呈負相關，提示PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者的胰島素抵抗、月經失調、T細胞亞群失調等癥與CD4+CD25+調節性T細胞的功能狀態存在密切聯系，而Foxp3 mRNA與糞便球桿菌比呈負相關則說明腸道菌群失調可能是CD4+CD25+調節性T細胞功能降低的原因之一。

綜上所述，本研究發現PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者CD4+T細胞/CD8+T細胞及Th1/Th2均存在失衡狀態，同時CD4+CD25+調節性T細胞功能降低，但他們之間是否存在因果關系尚需進一步研究。通過糾正CD4+CD25+調節性T細胞功能狀態或可是治療PCOS合并甲狀腺抗體陽性患者的新思路。