MMR、p53及 PD-L1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義

張聞雯 鄧再興 陳莉萍 賴世平 沈源明

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，患者呈年輕化趨勢(shì)[1-2]。手術(shù)結(jié)合術(shù)后輔助治療是EC最常見(jiàn)的治療方法。2013年美國(guó)癌癥基因組計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）提出EC分子分型計(jì)劃，將EC劃分為4類不同亞型：DNA聚合酶ε（DNA polymerase espilon，POLE）突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）型、低拷貝數(shù)（copy number abnormalities low，CNL）型和高拷貝數(shù)（copy number abnormalities high，CNH）型[3]。研究證實(shí)，TCGA分型比傳統(tǒng)的病理形態(tài)學(xué)分型能更準(zhǔn)確地指導(dǎo)EC患者術(shù)后治療及預(yù)測(cè)預(yù)后。不同分子特征可能導(dǎo)致輔助放化療敏感性差異，根據(jù)TCGA分型特征給予個(gè)體化精準(zhǔn)輔助治療是未來(lái)EC治療的發(fā)展趨勢(shì)。近年來(lái)，腫瘤免疫治療的快速發(fā)展打破了腫瘤的常規(guī)治療模式，尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤治療中的應(yīng)用[4]。程序性死亡蛋白1（programmed death protein-1，PD-1）/程序性死亡蛋白配體 1（programmed death protein-ligand 1，PD-L1） 在腫瘤組織及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）中的表達(dá)是篩選免疫治療潛在獲益人群的一項(xiàng)指標(biāo)。研究表明在POLE突變型、MSI型的EC中PD-1/PD-L多高表達(dá)，多對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑敏感,然而TCGA分型檢查過(guò)程繁瑣且價(jià)格昂貴，難以臨床推廣[5]。有學(xué)者提出一些簡(jiǎn)化方法試圖替代TCGA分子分型，如根據(jù)免疫組化檢測(cè)錯(cuò)位修復(fù)（mismatch repair，MMR）蛋白及抑癌基因p53表達(dá)情況將EC分為MMR缺失型/MMR完整型和p53突變型/p53野生型[6-8]。但對(duì)于這種簡(jiǎn)化分型與傳統(tǒng)病理分型的相關(guān)性，以及其是否可輔助用于免疫檢查點(diǎn)抑制劑適用人群的篩選尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)MMR蛋白、p53及PD-L1在EC中的表達(dá)情況，并分析簡(jiǎn)化的MMR/p53分子分型與EC的臨床病理特征以及PD-L1表達(dá)的相關(guān)性，以期為免疫檢查點(diǎn)抑制劑在EC中的應(yīng)用提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2015年1月至2018年12月在湖州市婦幼保健院行子宮切除術(shù)的EC患者78例。所有患者均為初次治療、術(shù)前未接受過(guò)內(nèi)分泌治療且無(wú)其它腫瘤病史；術(shù)后常規(guī)病理切片均經(jīng)2位病理科醫(yī)師重新評(píng)估。患者年齡28～90歲，平均56.9歲，其中≤50歲22例，＞50歲56例。臨床分期采用2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）標(biāo)準(zhǔn)分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別 59 例、8例、5例、6例。病理組織類型為子宮內(nèi)膜樣癌61例，非子宮內(nèi)膜樣癌 17例，包括漿液性癌10例，混合性癌2例，去分化癌2例，肉瘤、透明細(xì)胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌各1例；黏膜內(nèi)癌15例，肌層浸潤(rùn)≤1/2者43例，肌層浸潤(rùn)＞1/2者20例；脈管陽(yáng)性22例，陰性 56例；57例行淋巴結(jié)切除，其中陽(yáng)性9例，陰性48例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 患者均采用免疫組化EnVision二步法檢測(cè)MMR蛋白、p53及PD-L1表達(dá)情況。MMR蛋白相關(guān)抗體包括鼠抗人MutL同源蛋白1（MutL homolog 1，MLH1）、MutS 同源蛋白 2（MutS homolog 2，MSH2）、MutS 同源蛋白 6（MutS homolog 6，MSH6）、減數(shù)分裂后分離蛋白 2（Postmeiotic segregation increased 2，PMS2）單克隆抗體及p53蛋白購(gòu)自福建邁新公司，兔抗人PD-L1單克隆抗體（CAL10）購(gòu)自美國(guó)Pathcom system公司。具體操作：石蠟切片62℃烤箱過(guò)夜，脫蠟和水化，使用 EDTA緩沖液高壓修復(fù)，室溫自然冷卻。3% H2O2溶液常溫避光孵育，PBS緩沖液沖洗后加一抗，室溫孵育60 min。PBS緩沖液沖洗3遍，加Max VisionTM2/HRP，室溫孵育后PBS緩沖液沖洗。DAB顯色，顯微鏡下觀察染色進(jìn)展，染色成功后過(guò)水沖洗，蘇木素復(fù)染，流水返藍(lán)，乙醇脫水二甲苯透明，封片后鏡檢。

1.3 結(jié)果判讀 由2位病理科醫(yī)生進(jìn)行雙盲獨(dú)立閱片。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 及 p53均定位于細(xì)胞核，內(nèi)對(duì)照為正常淋巴細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞，4種MMR蛋白細(xì)胞核中均出現(xiàn)棕褐色著色即判定為MMR表達(dá)完整，如有一種及以上MMR蛋白未出現(xiàn)核著色則判定為MMR表達(dá)缺失。p53以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。p53呈現(xiàn)彌漫陽(yáng)性（＞70%）或完全陰性時(shí)，均判定為p53突變型，否則為p53野生型。PD-L1的陽(yáng)性對(duì)照為扁桃體組織，定位于細(xì)胞膜，呈黃色或棕黃色染色。計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞PD-L1陽(yáng)性數(shù)，≥1%定義為陽(yáng)性，＜1%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用χ2分割法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR蛋白及p53在EC中的表達(dá)情況 MMR完整型60例，缺失型18例，缺失率為23.07%。其中單個(gè)蛋白PMS2缺失 9例，MSH6缺失2例，MSH2缺失1例，MLH1與PMS2共同缺失4例，MSH2與MSH6共同缺失2例。p53突變型21例，p53野生型57例，突變率為26.92%。

2.2 MMR蛋白及p53的表達(dá)與EC患者臨床病理特征的關(guān)系 MMR缺失型表達(dá)率與EC患者年齡、腫瘤病理類型、FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度、脈管浸潤(rùn)情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。p53突變型表達(dá)率與EC患者年齡、腫瘤病理類型、FIGO分期、脈管浸潤(rùn)情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.05），在＞50歲、非子宮內(nèi)膜樣癌、晚期內(nèi)膜癌（Ⅲ+Ⅳ）、脈管陽(yáng)性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者中表達(dá)率升高，而與EC患者腫瘤肌層浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)（P ＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 EC中PD-L1表達(dá)與MMR蛋白及p53表達(dá)的關(guān)系分析 PD-L1在p53突變型患者中的陽(yáng)性表達(dá)率高于野生型患者（P＜0.05），而在MMR缺失型/完整型患者中陽(yáng)性表達(dá)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 PD-L1表達(dá)與MMR及p53蛋白的關(guān)系[例（%）]

根據(jù)MMR蛋白及p53表達(dá)情況將78例EC患者分成4組：MMR缺失型且p53突變型組2例，MMR缺失組且p53野生型組16例，MMR完整型且p53突變型組19例，MMR完整型且p53野生型組41例。PD-L1在這4組患者中的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。其中PD-L1在MMR缺失型且p53突變型組表達(dá)率最高，達(dá)100%，在MMR完整型且p53突變型組和MMR缺失組且p53野生型組中表達(dá)率相近，分別為73.68%和62.50%；在MMR完整型且p53野生型組表達(dá)率最低，為31.71%。其中，PD-L1在MMR完整型且p53突變型組與MMR完整型且p53野生型組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 PD-L1在不同MMR/p53分子分型EC中的表達(dá)情況比較[例（%）]

3 討論

以往臨床對(duì)EC的分類大多為基于病理組織形態(tài)學(xué)，但這種方法主觀性強(qiáng)，可重復(fù)性差，對(duì)預(yù)后的評(píng)估及對(duì)臨床指導(dǎo)術(shù)后價(jià)值有限，不能滿足臨床需求。TCGA提出的EC的新的分子分類更能反應(yīng)腫瘤的預(yù)后，更好地指導(dǎo)臨床，具有里程碑意義。但其推廣困難，研究者們致力于改良TCGA實(shí)驗(yàn)方法，尋求簡(jiǎn)便實(shí)用的分子分類方法。

MMR蛋白是MMR基因編碼的蛋白產(chǎn)物，在DNA復(fù)制過(guò)程中保證其高度保守性和遺傳的穩(wěn)定性。在EC的發(fā)病機(jī)制中，主要有4種MMR蛋白起關(guān)鍵作用，分別是 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，它們?cè)谌梭w內(nèi)以MLH1與PMS2結(jié)合，MSH2與MSH6結(jié)合形成二聚體復(fù)合物發(fā)揮作用。MMR蛋白表達(dá)缺失導(dǎo)致 DNA堿基錯(cuò)配無(wú)法校正，引起具有微衛(wèi)星短串聯(lián)重復(fù)序列長(zhǎng)度改變，導(dǎo)致MSI發(fā)生。免疫組化法和PCR法檢測(cè)MSI是目前相對(duì)簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的方法，Stelloo等[9]應(yīng)用2種方法對(duì)696例EC患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者具有高度一致性。本研究中，MMR缺失型為23.07%（18/78），略低于TCGA分子分型中MSI高突變組（30%），其中以PMS2單個(gè)蛋白缺失最多見(jiàn)（11.54%），MLH1與PMS2配對(duì)缺失次之（5.13%）。18例MMR缺失型中，14例為中-高級(jí)別子宮內(nèi)膜樣癌，1例為漿液性癌，1例為混合型癌（漿液性癌+透明細(xì)胞癌），僅2例為低級(jí)別子宮內(nèi)膜樣癌。MMR蛋白缺失與EC患者的預(yù)后關(guān)系存在爭(zhēng)議，目前尚無(wú)統(tǒng)一定論。Pakish等[10]用免疫組化檢測(cè)了156例EC患者的MMR蛋白后發(fā)現(xiàn)，患者年齡、臨床分期、腫瘤組織學(xué)分類及病理學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)情況均與MMR蛋白是否缺失無(wú)關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Nagle等[11]對(duì)澳大利亞728例EC患者生存分析結(jié)果顯示，EC的危險(xiǎn)因素與MMR狀態(tài)無(wú)關(guān)。但國(guó)內(nèi)晉薇等[12]認(rèn)為MMR蛋白表達(dá)缺失提示患者不良預(yù)后。他們研究顯示，MMR缺失型EC多為低分化、FIGO分期晚，伴有深肌層浸潤(rùn)、脈管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。也有學(xué)者認(rèn)為MMR缺失型EC更易有磷酸酶張力蛋白同源酶（phosphatase and tensin homology，PTEN）突變，不伴有 p53 突變，惡性程度低，不易發(fā)生淋巴結(jié)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[13]。Black等[14]發(fā)現(xiàn)，MMR缺失型EC患者的無(wú)病生存率和特異性生存率均有明顯改善。

MMR蛋白缺失型EC患者大多數(shù)是散發(fā)病例，僅有約3%患有遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（Lynch綜合征）。Lynch綜合征是由MMR基因突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳病，患者有高發(fā)EC、結(jié)腸癌、卵巢癌、胃癌等風(fēng)險(xiǎn)，而50%的女性患者中常以EC作為前哨癌。因此，對(duì)MMR缺失型患者及親屬進(jìn)一步進(jìn)行基因檢測(cè)及遺傳學(xué)咨詢意義重大。

p53突變發(fā)生在10%～20%的子宮內(nèi)膜樣癌和90%的漿液性癌[15]中，它是一種抑癌基因，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。p53突變會(huì)喪失正常抑制癌細(xì)胞的作用，甚至能夠促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。以往的研究提示p53突變是預(yù)后不良的因素，如Talhouk等[7]用p53免疫組化代替拷貝數(shù)檢測(cè)得到的p53突變型中，多為非子宮內(nèi)膜樣癌，且級(jí)別高、進(jìn)展快、預(yù)后差。本研究結(jié)果也提示p53突變型中患者年齡大，多為疾病晚期，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，脈管浸潤(rùn)，多為非子宮內(nèi)膜樣癌，該結(jié)果提示p53突變型可能是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的重要因素之一。

當(dāng)前以PD-1/PD-L1為靶點(diǎn)的免疫治療已成為腫瘤強(qiáng)有力的新的治療方法，PD-L1表達(dá)于多種腫瘤組織中，其與配體PD-1結(jié)合后，抑制CD4+T細(xì)胞的增殖和活化，同時(shí)使IL-2和INF-α分泌下調(diào)，抑制T細(xì)胞功能，從而形成腫瘤免疫抑制的微環(huán)境，使得腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視。文獻(xiàn)報(bào)道MMR缺失型EC具有較高的突變率，腫瘤周圍具有豐富的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，患者是PD-1/PD-L1免疫治療的受益群體[3，16]。多個(gè)臨床研究表明，MMR缺失型患者的PD-L1蛋白表達(dá)率明顯升高，且經(jīng)免疫治療后，臨床緩解率明顯高于MMR完整型患者[17-19]。本研究顯示，PD-L1在EC中表達(dá)率為50%，在MMR缺失型中略高，表達(dá)率為66.7%，在p53突變型中最高，達(dá)76.2%。在結(jié)合MMR及p53蛋白分組中，PD-L1在這4組的表達(dá)有差異，主要在MMR完整型且p53突變型組與MMR完整型且p53野生型組之間，說(shuō)明PD-L1的表達(dá)與p53突變或野生相關(guān)，與MMR蛋白表達(dá)完整或缺失不相關(guān)。這與上述文獻(xiàn)報(bào)道不符，可能與PD-L1克隆號(hào)不同有關(guān)，也可能與本研究樣本量較小有關(guān)。

本研究中有2例患者同時(shí)出現(xiàn)MMR缺失和p53突變，患者年齡均56歲，1例為漿液性癌，F(xiàn)IGOⅢ期，1例為混合性癌（漿液性癌+透明細(xì)胞癌），F(xiàn)IGO為Ⅳ期，均伴有附件浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Leon-Castillo等[20]分析了64例同時(shí)發(fā)生MMR缺失和p53突變的EC的臨床病理特征、分子表型及相關(guān)預(yù)后，他們認(rèn)為這類EC的p53突變是腫瘤發(fā)展過(guò)程中的繼發(fā)性事件，他們建議應(yīng)將這類EC歸入MMR缺失型EC。本研究中2例均為晚期患者，病程進(jìn)展快，但PD-L1均陽(yáng)性表達(dá)，提示PD-1/PD-L1免疫治療可能使之收益。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，p53蛋白對(duì)EC的預(yù)后及分型具有重要意義，MMR蛋白檢測(cè)為EC患者進(jìn)行Lynch綜合征分流提供依據(jù)。PD-L1在MMR缺失且p53突變組表達(dá)，提示免疫治療可能使該分子亞型患者受益。EC是一組高度異質(zhì)性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展具有多種分子通路，本研究為回顧性分析，樣本量有限，對(duì)于EC的分子分型策略還需進(jìn)一步深入的多中心臨床研究以獲得更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。