太湖花鱉雌雄群體形態及遺傳差異分析

王苗苗　梅肖樂　馮子偃　徐建榮　韓曉磊

摘要：通過多元統計分析和線粒體DNA測序技術，對中華鱉地方特色品種——太湖花鱉雌雄群體的形態和遺傳差異進行了分析研究。結果顯示，在形態上，對太湖花鱉雌雄群體各項形態參數進行t檢驗差異分析，發現雄性尾部的生長與其體質量的增加相關顯著，呈線性關系;對太湖花鱉雌雄群體形態參數進行主成分分析，并作出主成分1和主成分2的散點圖，得出雌雄群體形態差異不明顯。對太湖花鱉雌雄群體線粒體D-loop控制區序列進行差異分析，雌雄群體間遺傳差異為0.0114;構建N-J聚類系統樹，雌雄群體無單獨聚類，群體遺傳差異不明顯。結果表明，太湖花鱉個體形態差異與其性別存在一定程度的相關性，特別是尾部特征，可用于雌雄性別的初步判斷，但雌雄群體在外觀形態和線粒體DNA上均沒有明顯差異。

關鍵詞：太湖花鱉;多元統計分析;D-loop控制區;形態差異;遺傳差異

中圖分類號：S966.5文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0142-04

作者簡介：王苗苗（1987—），女，江蘇南京人，碩士，水產工程師，主要從事水生生物學研究和水產技術推廣工作。E-mail：miaomiaotgz@163.com。

通信作者：韓曉磊，碩士，高級實驗師，從事淡水水生生物學研究。E-mail：84125241@qq.com。

多元統計分析可根據形態特征的多個參數，對多個互相關聯的指標和對象進行統計分析以揭示其規律，符合農業科學的研究特征[1]。目前，多元統計分析已在水生動物的物種種質評定、種群遺傳變異、性別差異分析等領域開展了大量的研究，然而對龜鱉類物種的研究還鮮有報道[2-6]。線粒體DNA作為細胞中遺傳信息的重要載體，具有長度短、含量高、進化速度快和母性遺傳等特點，特別是D-loop控制區，因其不編碼蛋白，承受選擇壓力較小，是線粒體DNA中進化最快的部分，已成為水生動物種類鑒定、遺傳多樣性、遺傳變異、系統進化、性別差異等方面的研究熱點[7-13]。

太湖花鱉屬于中華鱉（Trionyxsinensis）的地方特色品種，主要分布于長江中下游，太湖流域居多，與普通中華鱉體色差異較大，特別是在自然狀態下體色油綠，背部有對稱小圓黑斑，腹部有明顯塊狀灰黑花斑，由此得名;并因其較高的營養價值和良好的口感風味受到人們青睞，江南地區多有養殖，市場前景廣為看好。太湖花鱉雌雄體在形態規格及生長特性上存在一定差異，本研究通過多元統計分析和線粒體D-loop控制區分析，于表型和基因型多方面對太湖花鱉雌雄特征予以揭示，以期為太湖花鱉雌雄鑒別，以及種質鑒定、資源保護和利用提供一定的理論支持。

1材料與方法

1.1材料來源

太湖花鱉樣品是在2017—2018年取自太湖常州武進段的野生群體，共計取樣30只，其中，雌雄各半，試驗于2019年在長江特色水產工程技術研究中心完成。太湖花鱉活體用于形態參數統計分析，之后取樣品腿部肌肉組織于-70℃冰箱中保存，以備提取DNA使用。

[FK（W11][TPWMM11.tif;S+3mm][FK）]

1.2形態參數測量

游標卡尺測量每尾太湖花鱉的體高、頭長和頭寬等16項形態指標（精度為0.1mm），電子天平測量每尾太湖花鱉的體質量（精度為0.1g），具體測量方法參考國家標準（GB2104—2007）[14]，具體指標見表1、表2。鑒于活體太湖花鱉不便于測量，故可將其放入密閉容器，進行乙醚吸入式麻醉后方可精確測量。

1.3D-loop控制區的PCR擴增及測序

參照韓曉磊等的研究方法[15]提取太湖花鱉樣品基因組DNA并檢測其完整性，測定其濃度后于-20℃保存備用。太湖花鱉2對擴增D-loop控制區的引物序列分別為：T1（5′-3′）：[JP9]ATCTTACCCCTACTACACACAT;T2（5′-3′）：[JP9]AGACTGGTGATGGAGTATC;T3（5′-3′）：[JP9]GCCACAATACTTGTTTATCT;T4（5′-3′）：[JP9]AATATCCATCTTGGCGTCTTCA。PCR擴增反應參見陸文浩等的方法[16]具體操作，并測得太湖花鱉樣品線粒體DNA序列。

1.3數據處理

1.3.1形態參數分析

試驗數據采用SPSS19.0軟件進行分析，本研究多元分析方法包括t-檢驗和主成分分析，它們是針對多個研究對象同時進行分析所得數據的運算方法。通過將背甲長作為基數，以取得2個形態參數比值，從而消除鱉體規格大小對多元分析中參數值的影響。

1.3.2D-loop控制區序列分析

所獲得太湖花鱉D-loop控制區序列經過校對處理后，采用軟件ClustalX2.1和MEGA5.1進行序列比對和分析，通過Kimura雙參數模型統計雌雄群體群間遺傳差異，運用鄰接法構建系統發生樹，以bootstrap進行檢驗，重復1000次。

2結果與分析

2.1形態差異分析

由表1可知，太湖花鱉雄鱉體質量與尾長關系的r=0.662（r>r0.01），尾部生長與體質量增加相關性顯著，其一元線性回歸方程為：Y體質量=44.473X尾長+115.837，回歸顯著性檢驗F=10.143，F>F0.01;太湖花鱉雌鱉體質量與尾長關系的r=0.445（r

2.2主成分分析

由表2可知，太湖花鱉雌雄群體方差貢獻率較高的4個主成分貢獻率分別為43.163%、14.427%、8.812%和8.600%，其累積貢獻率為75.003%，包含了群體總變異的大部分，可見以上4個相互獨立的主成分可代表太湖花鱉雌雄群體間的形態差異。在主成分1中，變量X2、X3、X4、X6、X7、X8、X9、X12和X13影響最大;在主成分2中，變量X10、X11和X14影響最大;在主成分3和主成分4中，變量X2影響最大。背甲周長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬和尾長是主成分1變異貢獻的主要形態指標，可見太湖花鱉鱉體長度、寬度和尾長是引起其雌雄群體形態差異的主要指標。

由圖2可知，太湖花鱉雌雄群體主成分1和主成分2為相對值，雌雄群體之間存在部分重疊，主成分1和主成分2不能準確將雌雄群體進行區分，故太湖花鱉雌雄群體總體形態差別較小，形態差異統計分析較難將其準確鑒別。

2.3D-loop控制區序列分析

2.3.1太湖花鱉線粒體D-loop控制區序列比較

測序所得序列與GenBank中序列號為AY687385.1的中華鱉線粒體DNA序列進行Blast同源性比對，證實所測序列位于第15321位到15835位之間，大小為515bp，堿基組成分別為G、C、T和A的堿基平均含量分別為10.0%、30.0%、32.9%和27.1%，其中T+A含量（60.0%）高于G+C含量（40.0%），是線粒體DNA典型的反G偏倚特征。太湖花鱉雌雄群體的群內遺傳相似度為99.23%。

2.3.2太湖花鱉分類地位鑒定

根據D-loop控制區序列差異，用MGEA5.1分析2個群體的遺傳距離，由圖3可知，發現雌雄群體間遺傳差異為0.0114。構建聚類系統發生樹，太湖花鱉雌雄群體混為一體，群內個體無單獨聚類。

3討論

t檢驗是用于小樣本（樣本容量小于30）的2個平均值差異程度的檢驗方法，它是用T分布理論來推斷差異發生的概率，從而判定2個平均數的差異是否顯著[17-18]。本研究中，太湖花鱉雄性尾巴的生長與其體質量的增加顯著相關，可用于太湖花鱉雌雄性別的鑒別;主成分分析中尾長也是引起形態差異的主成分變量之一，且需與其他形態變量共同作用進行差異分析。珠水對中華鱉性別鑒別方法進行了研究，指出雄性中華鱉較之雌性尾巴較長，大多能自然伸出裙邊外，故尾部特征可以作為雌雄判別的重要依據[19]，此結論與本研究結果基本一致。然而，在太湖花鱉雌雄群體30個樣本的散點圖分析結果中，太湖花鱉雌雄群體并沒有明顯區分。以上推斷表明，太湖花鱉個體形態差異與其性別存在一定程度的相關性，特別是尾部特征，可用于雌雄性別的初步判斷，但其群體的形態差異并不明顯，還需更多的參數乃至更深入的分析研究予以揭示。

本研究通過線粒體D-loop控制區序列比對差異分析，發現太湖花鱉雌雄群體群間遺傳差異僅為0.0114，可以認為2個群體間不存在有效遺傳差異。太湖花鱉雌雄群體聚類系統發生樹中2個群體的群內個體未按照性別差異單獨聚類，同樣揭示雌雄群體群間遺傳差異并不明顯。

綜上所述，太湖花鱉雌雄群體在外觀形態上可通過尾巴長短進行簡單區分，但進行準確的分辨還相對較難，線粒體DNA差異同樣不明顯。由此推斷，太湖花鱉雌雄群體差異在外觀形態只有微小的體現，而在水產養殖中，雄鱉生長速度快于雌鱉，成熟的雄性個體比雌性大且一般為雌性的3倍左右[17]，揭示太湖花鱉雌雄差異可能主要體現在生長速度上，故體質量的變化可作為研究方向。

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