流式細胞術動態監測微小殘留病在急性髓系白血病治療中的臨床意義

陳曉紅，吳廣勝，農衛霞，潘 歆，王 燕，張紅霞，章大謙，龍珍珠瑪

(1.新疆石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000；2.新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院血液科，新疆 石河子 832000)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是起源于造血系統的惡性克隆性疾病，白血病細胞在細胞周期中出現增殖失控、分化障礙和凋亡受阻，并且大量蓄積于骨髓和其他造血組織，從而抑制骨髓正常造血功能并浸潤多器官。近些年來，隨著化療、特異性靶向治療、骨髓移植等治療技術的不斷更新改進，其治療效果不斷提高，AML患者的總體疾病緩解率可達50%～80%，但是仍有著65%左右的患者大約在3～5年內復發[1]，成年人總體生存率僅為24%～28%[1-2]。AML誘導化療獲得形態學完全緩解后(complete remission，CR)，患者體內仍有108的白血病殘留細胞，被稱為微小殘留病(minimal residual disease,MRD)[3]。近幾年研究表明，微小殘留病檢測對AML患者的早期復發、預后判斷及調整治療方案等具有重要意義[4]。本文主要對我院AML患者的資料進行回顧性分析，討論MRD在AML疾病治療中的預后價值。

1 資料與方法

1.1研究對象：以2015年1月～2019年1月在石河子大學醫學院第一附屬醫院血液科確診的非M3型AML患者為研究對象，經除外主動放棄治療患者，最終獲得有效數據40例，其中有男24例，女16例，年齡19～82歲，平均56歲。40例中經初次誘導化療后未緩解(NR)或部分緩解(PR)13例，CR27例。AML診斷符合WHO 2016版《造血和淋巴組織腫瘤分類標準》[5]，臨床CR標準參照張之南《血液病診斷及療效標準》(第3版)[6](本次研究經過本院醫學倫理委員會同意)。

1.2治療方案：AML 誘導緩解采用標準 DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)、IA(去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷)方案，鞏固化療 AML 采用 DAMA、HA、HDA等。

1.3研究方法：

1.3.1MRD檢測方法：采用流式細胞術，抽取誘導治療后2周及緩解后鞏固治療前后患者骨髓作為標本,涂片6～8張作為形態學分析,同時采集3 ml骨髓用肝素抗凝,并送往北京海斯特公司進行流式細胞學數據采集并進行骨髓細胞形態學、染色體核型分析等檢測，結果采用MRD>0.01%作為MRD陽性標準。

1.3.2預后分層標準：根據成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2017年版)將納入患者按照細胞遺傳學和分子遺傳學檢測結果將確診患者分層為預后良好、預后中等、預后不良。

1.4統計學方法：采用SPSS19.0軟件對數據進行統計分析。定量資料采用配對設計資料的t檢驗或兩獨立樣本資料的t檢驗；定性資料采用獨立樣本R×C列聯表資料的χ2檢驗。按α=0.05的檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在本研究中，共有79名患者在4年的時間內累積，其中20例患者于確診后未在我院繼續治療，其余9名患者因經濟等不同原因放棄治療，10例患者最終FAB分型為M3型。將這些患者排除后，剩余40例患者納入這項研究來進行數據分析。

2.1首次化療后不同MRD水平的緩解情況以及與預后分層的關系：40例患者，首次化療后檢測MRD水平，其中MRD陽性組為21例，其中9例未達到形態學完全緩解，12達到形態學完全緩解，MRD陰性組共19例，其中形態學緩解患者15例，未達到形態學完全緩解患者為4例，MRD陽性組與MRD陰性組的緩解情況無統計學意義(P>0.05)。

40例AML患者，預后良好組患者共9例，首次誘導治療后MRD陰性患者7例，MRD陰性率77.70%；預后中等組14例患者中首次誘導后MRD陰性患者8例，MRD陰性率57.10%；預后不良組患者共17例，其中MRD陰性患者4例，MRD陰性率23.50%。三組的差異具有統計學意義(χ2=9.026，P=0.029)，見表1。

表1 MRD水平與細胞遺傳學分布相關性關系

2.2完全緩解患者不同MRD水平與復發的關系：27例達到形態學完全緩解的患者持續動態監測MRD水平并進行隨訪，最終9例MRD持續陽性患者復發8例，復發率88.89%，MRD持續陰性患者11例，復發3例，復發率27.27%，MRD水平由陽性轉為陰性患者3例，復發2例，復發率66.67%，MRD水平由陰性轉陽性患者4例，復發1例，復發率25.00%，四組復發率差異有統計學意義(χ2=9.026，P=0.029)，見表2。

表2 形態學完全緩解時不同MRD水平與復發率的關系

2.3緩解后不同MRD水平患者的生存曲線：27例緩解患者中，據統計至隨訪結束，初次化療后MRD為陽性水平的平均生存時間為18.71(95%CI:11.13～26.28)，中位生存時間12.00(95%CI:6.91～17.09);陰性水平的平均生存時間為30.30(95%CI:4.32～21.82)。首次化療后不同MRD水平的生存曲線如圖1。

圖1 完全緩解患者首次化療后不同MRD水平的生存曲線

3 討論

急性髓系白血病(AML)是造血系統的惡性腫瘤性疾病。近年來，AML的治療方法和水平不斷進步，但是AML患者體內的MRD并未被完全清除，這也就導致著AML患者預后不能達到理想狀態。故而，作為目前研究的熱點，AML的治療的終極目標是在完全緩解的基礎上檢測出MRD并完全清除從而達到長期無病生存甚至治愈。因而，本文旨在通過對我院AML患者的臨床資料進行回顧性分析從而評價MRD在AML中的臨床價值。

本研究對40例AML患者在初次誘導化療后通過流式細胞術檢測MRD水平，并分析其形態學緩解情況，發現不同MRD水平之間的CR率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。同時在AML患者診斷初期對其依據細胞遺傳學及分子遺傳學進行預后分層，對各層患者的初治后MRD水平進行檢測，結果發現，相比于預后中等組和預后不良組，預后良好組具有更高的MRD陰性率(77.70%)，而其他兩組MRD陰性率僅為57.10%、23.50%。細胞遺傳學和分子遺傳學預后分層能夠在治療前對AML患者做出一定的預后判斷，結合初治MRD檢測水平后可能能夠更精準預測預后，從而能夠在治療早期選擇合適的治療方案，以便獲得早期緩解及早期預防復發，從而提高患者的緩解率及延長無病生存期等。隨后筆者又對其中27例獲得CR的患者MRD水平進行動態檢測并追蹤隨訪，我們發現MRD持續陽性患者復發8例，而MRD持續陰性患者僅復發3例，MRD持續陽性組復發率遠高于MRD持續陰性組(88.89%VS27.70%)，表明MRD的持續存在是復發的根源，這是由于，在臨床上完全緩解的概念是指患者血液學指標提示骨髓中白血病細胞計數<5%，但是這僅僅不足5%的白血病細胞可能造成惡性克隆性增殖，從而導致疾病難以控制；本文還對CR不同MRD水平的患者進行了生存分析，結果顯示MRD陽性組與MRD陰性組生存期并無差異，這與國內外大多數研究結果不一致，需增加樣本量及延長隨訪時間進行進一步統計分析。

AML復發是其預后不良因素之一[7]。國內牟銳等[8]對129例初治復發AML患者進行MRD早期檢測結果顯示：MRD早期轉陰者與MRD陽性者CR率比較，分別為26.53%與83.87%(P<0.001)。隨訪半年后發現MRD陽性組復發率遠高于MRD陰性組。此結果與本文結果相似，高水平MRD可導致高復發風險，但是，MRD陰性并不能完全排除復發，本文中MRD持續陰性組尚有3例復發，故而，早期檢測MRD并不能作為預測復發情況的唯一證據，仍需流式細胞術持續動態監測MRD水平；目前普遍認為，在AML治療過程中，MRD水平是一項獨立的預后因素。有研究對346例患者的2 569個骨髓樣本進行了MRD監測，并進行了多因素分析結果顯示，微小殘留病的存在是死亡的唯一獨立預后因素[9]。本文通過MRD水平聯合分子學預后分層，對不同預后分層的MRD陰性率進行了比較，發現分子學預后較好的組可以獲得較高的MRD陰性情況，這與國內某研究[10]有著完全相反的結論。更多國外研究表明[11-12]，NPM1突變與好更高的CR、改善總的OS、更低的復發累積發生率相關，而FLT3等預后不良基因則恰好相反，這與本文研究基本符合。Terwijn M等[13]報道517成年AML患者動態檢測結果顯示：MRD水平≥0.1%具有高復發風險。而Jentzsch M等[14]的研究則以MRD 0.01%為界限，水平>0.01%的患者3年復發率是水平<0.01%患者的3倍以上，因此認為可以將MRD檢測結果作為預后分層標準之一，從而對治療方案進行動態調整，MRD持續陰性者則可以降低治療強度，MRD持續陽性這則考慮改變化療方案、增強化療或進行骨髓移植等。

國內外關于AML-MRD檢測的方法和時間點不盡統一。國內大多數檢測方法為多參數流式細胞術(multiparametric flow cytometry，MFC)[15]，相比于傳統形態學檢測方法，此法具有檢測簡便，敏感性較高等優點，但是僅能檢測白血病細胞異常表面抗原，不能對正常免疫表型的白血病細胞做出評估。而國外多采用實時定量PCR(rt-qPCR)和二代測序(NGS)作為AML-MRD的檢測方法，雖然相較于流式細胞術，以上兩種方法能夠獲得更好的敏感性，但由于上述方法局限于檢測技術人員的經驗與操作水平，并不能獲得客觀的MRD評估，如若能夠將以上幾種常用方法結合進行AML-MRD檢測，可能能夠取得更有效的結果。AML-MRD檢測的時間點，國內外不同實驗室選擇不同的時間點，包括誘導化療后7 d、誘導治療開始后14 d、16 d、第 1 次形態學 CR 后、誘導化療和強化化療末等[16-17]，均發現MRD陽性組的復發率遠高于MRD陰性組，且具有更低的無病生存期[18]。歐洲白血病網[19]建議至少在診斷時、兩個誘導/鞏固治療周期后、隨訪期間每3個月進行MRD評估與預測預后、防止復發有重要作用。本研究采用初次誘導后2周作為早期MRD水平檢測，在鞏固治療和強化治療前后均檢測MRD水平，從而對疾病復發和預后做出評估，結果與國內外多數研究結果一致。

綜上所述，AML患者在治療期間動態監測MRD水平對于提前判斷復發，及時調整合適的治療方案，進行個性化治療，有效提高患者的預后有著十分積極的作用和臨床應用價值。若可將MRD水平作為預后分層標準，與分子遺傳學及細胞遺傳學預后分層結合，可能能夠對患者的預后做出更為精準的預測。并且隨著二代測序技術(NGS)的發展， 逐漸發現眾多遺傳標志物(如IDH1、IDH2、WT-1等)的發現及應用，MRD檢測將在AML的治療中起到越來越重要的作用。