肝細胞癌患者PBMCs TLR 2/4表達和小腸細菌過度生長對TACE術后生存期的影響*

許 超，王森鈺，羅援燁，陳王麗，周 蕓，盛以泉，郭滿盈

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范圍內最常見的腫瘤，肝動脈化療栓塞(transcatheter arterial embolization，TACE)治療是錯過最佳手術時機患者的首選治療方法，但術后腫瘤復發(fā)或轉移時有發(fā)生，影響患者預后[1-3]。據(jù)文獻報道，慢性肝臟疾病患者腸道微生態(tài)遭到損害，存在菌群失調和細菌移位，易引發(fā)小腸細菌過度生長(small intestinal bacterial overgrowth，SIBO)[4-6]。SIBO能夠通過Toll 樣受體(Toll-like receptor，TLR)不同信號途徑加重肝損害，導致HCC的發(fā)生，還可導致腸內毒素產(chǎn)生或吸收增多，引起內毒素血癥，加劇病情發(fā)展。TLR2和TLR4是大量表達于外周血單個核細胞(peripheral blood monocytes，PBMCs)表面的受體分子，在非特異性免疫過程中具有識別作用，可參與對腫瘤的免疫監(jiān)視，在HCC發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。目前，有研究表明慢性肝臟疾病患者PBMC表面TLR2和TLR4的表達與SIBO有一定的關系[7，8]。本研究檢測了47例接受TACE治療的HCC患者PBMCs表面TLR2和TLR4表達和SIBO情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1月～2016年6月我院收治的HCC患者47例，男性29例，女性18例；年齡43～77歲，平均年齡為(56.87±6.63)歲。符合中華醫(yī)學會腫瘤學分會修訂的原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治的專家共識的診斷標準[9]，腫瘤直徑為3～7 cm，平均為(5.03±0.56)cm；TNM分期：Ⅲ期30例、Ⅳ期17例。納入患者肝功能Child-Pugh分級為A級/B級，Karnofsky評分≥60分。排除標準：①轉移性肝癌；②既往有心、腦血管疾病，合并肺部疾病或腎功能不全；③惡液質；④伴有嚴重的全身感染；⑤過敏體質；⑥既往有肝移植手術史或3個月內接受過大型手術史。另選擇同期在本院體檢的100例健康人作為對照組，男性59例，女性41例；年齡為39～75歲，平均年齡為(55.67±10.34)歲。兩組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核通過，患者給出知情同意書。

1.2 治療方法 所有HCC患者均接受TACE治療，應用的化療藥物為黃石李時珍藥業(yè)集團武漢李時珍藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的注射用羥基喜樹堿(國藥準字H20030315)等和明膠海綿顆粒作為血管栓塞劑。

1.3 有關檢測 抽取空腹靜脈血2 mL，置于美國BD公司提供的肝素抗凝管內，使用美國貝克曼CytoFLEX流式細胞儀檢測PBMCs表面TLR2和TLR4表達，以平均熒光強度的幾何均數(shù)(geometric mean fluorescence，GMF)表示。

1.4 SIBO評估 使用英國EC60Gastrolyzer氫氣檢測儀，以荷蘭Abbott Biologicals B.V.生產(chǎn)的乳果糖口服液(注冊證號H20171057)為底物，嚴格按照乳果糖氫呼氣試驗(lactulose hydrogen breath test，LHBT)操作規(guī)程檢測。SIBO陽性判定標準：空腹基礎呼氣氫氣濃度>20 ppm或試餐后呼氣氫氣濃度上升超過12 ppm，即為SIBO陽性；反之，則為SIBO陰性[10]。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用t檢驗，計數(shù)資料用x2檢驗，采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，分別以3年總生存率和3年無事件生存率作為觀察終點，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC組與健康人SIBO陽性率及PBMCs表面TLR2和TLR4陽性表達強度比較 HCC組SIBO陽性率及PBMCs表面TLR2+和TLR4+細胞表達強度顯著高于健康人(P<0.05，表1)。

表1 兩組SIBO陽性率(%)及PBMCs表面TLR2和TLR4陽性表達強度比較

2.2 SIBO陽性與SIBO陰性HCC患者PBMCs表面TLR2和TLR4陽性表達強度比較 SIBO陽性組PBMCs表面TLR2+細胞和TLR4+細胞表達強度顯著高于SIBO陰性組(P<0.05，表2)。

2.3 不同生存期患者SIBO陽性率及PBMCs表面TLR2和TLR4陽性表達強度比較 在本組47例HCC

表2 SIBO陽性與SIBO陰性HCC患者PBMCs表面TLR2和TLR4陽性表達強度比較

患者中，術后失訪1例(2.1%)SIBO陽性患者。46例HCC患者生存期為(19.09±1.90)個月，以中位生存期16個月為界，結果短生存23例，長生存23例。長生存組PBMCs表面TLR2+細胞和TLR4+細胞表達強度和SIBO陽性率顯著低于短生存組(P<0.05，表3)。

表3 兩組SIBO陽性率(%)及PBMCs表面TLR2和TLR4陽性表達強度比較

2.4 PBMCs表面TLR2和TLR4表達強度及SIBO對HCC患者術后生存期的影響 采用中位數(shù)法將HCC患者分為PBMCs表面TLR2高表達組(>91.5 GMF)和TLR2低表達組(≤91.5 GMF)各23例，也將TLR4分為高表達(>43.4 GMF)和TLR4低表達(≤43.4 GMF)組，各23例。生存分析顯示，TLR2高表達患者3 a累積生存率和3 a累積無事件生存率分別為17.4%和13.0%，顯著低于TLR2低表達組的52.2%和43.5%(P<0.05)；TLR4高表達患者3 a累積生存率和3 a累積無事件生存率分別為13.0%和8.7%，也顯著低于TLR4低表達組的56.5%和47.8%(P<0.05)；30例SIBO陽性患者3 a累積生存率和3 a累積無事件生存率分別為10.0%和3.3%，顯著低于16例SIBO陰性患者的81.3%和75.0%(P<0.05)。

3 討論

HCC確切病因或發(fā)病機制尚不明確，可能是多種因素共同作用的結果。流行病學資料顯示大部分HCC是在慢性肝炎，如HBV和HCV感染或肝硬化的基礎上發(fā)展而來[11，12]。近年來，腸-肝軸研究發(fā)現(xiàn)HCC患者腸道內需氧菌所占比例明顯增多，而厭氧菌所占比例明顯減少，推測腸道微生態(tài)可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13，14]。HCC患者低蛋白血癥、門脈高壓均可引起胃腸道淤血、水腫，腸道屏障功能、蠕動功能等各項生理功能減弱，易造成外來致病菌的入侵和繁殖，將大大增加繼發(fā)腸道菌群移位和SIBO的風險[15-17]。本研究HCC組SIBO陽性率為71.4%，顯著高于健康人的6.0%，提示HCC患者普遍存在小腸細菌過度生長。

TLRs是連接非特異性免疫和特異性免疫的單個跨膜非催化性蛋白質，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中能夠通過識別某些內源性配體發(fā)揮腫瘤免疫監(jiān)視的作用。據(jù)文獻報道，TLRs免疫耐受的打破可誘導肝臟持續(xù)的炎癥反應，加速慢性肝病發(fā)展為HCC的進程[18]。TLR2和TLR4均可通過病原相關分子模式防御外源性病原微生物的入侵，并通過疾病相關分子模式識別壞死細胞中纖維蛋白原和熱休克蛋白等內源性配體，在促進腫瘤細胞的生長和遷移中可發(fā)揮重要作用[19]。本研究中HCC組PBMC表面TLR2+細胞和TLR4+細胞表達強度顯著高于健康對照者，提示PBMC表面TLR2和TLR4介導的信號通路可促進HCC的發(fā)生進展。本研究中SIBO陽性組PBMC表面TLR2+細胞和TLR4+細胞表達強度顯著高于SIBO陰性組，提示SIBO可能是PBMC表面TLR2和TLR4表達水平上調的機制之一，而TLR2和TLR4表達水平上調又可通過介導肝臟炎癥反應，加重肝臟損傷，提高SIBO陽性率。SIBO可通過不同信號途徑激活TLR2和TLR4，誘導大量細胞因子的釋放，進一步加劇肝臟炎性反應，加快HCC的發(fā)展進程[20]。

本研究長生存組患者在入院時、治療后3個月和6個月外周血PBMC表面TLR2+細胞和TLR4+細胞表達強度及SIBO陽性率呈現(xiàn)明顯下降趨勢，且均顯著低于短生存期組，表明PBMC表面TLR2和TLR4表達及SIBO與HCC患者治療效果和預后關系密切，可作為療效評估的指標。生存分析顯示TLR2和TLR4高表達患者和SIBO陽性患者3 a累積生存率和3 a累積無事件生存率顯著低于TLR2和TLR4低表達及SIBO陰性患者，進一步說明TLR2和TLR4表達及SIBO與HCC患者的預后生存關系密切，TLR2、TLR4和SIBO可促進HCC細胞增殖、侵襲和遷移，加速HCC患者病情惡性發(fā)展，降低患者的術后生存率，有望應用于HCC患者的臨床預后評估。SIBO的形成可能加速了內毒素血癥的發(fā)生，后者可能激活了肝內庫佛氏細胞，加速細胞因子的分泌和釋放，后者可能作用于肝星狀細胞，誘導其分化和增殖，形成肝纖維化，加重肝損害。