不同稻秸平菇菌糠營養成分差異及其體外瘤胃發酵特性研究

姜奧宇，胡 蓮，陳 東*，唐啟源，郭 楠，沈維軍，萬發春，任 杰，李付強

（1.湖南農業大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.婁底市新化縣農業農村局，湖南婁底 417600；3.湖南農業大學農學院，湖南長沙 410128；4.瀏陽市動物疫病防控中心，湖南瀏陽 410300；5.湖南天華實業有限公司，湖南婁底 417000）

水稻作為我國重要農作物之一，年播種面積約為3 000 萬hm2，稻谷年產量為2 億t 以上[1]，按谷草比1:1[2]計算，每年產生水稻秸稈約為2 億t，通過測算，我國主要農作物秸稈總量呈穩步緩慢上升趨勢，其年平均增長率為1.66%。農作物秸稈氮、磷、鉀等礦物元素含量豐富，但纖維含量較高，養分利用率較低[3]，通過食用菌栽培方法可以提高秸稈利用附加值，發酵后菌糠可飼喂動物，對發展綠色農業、提升農業經濟效益具有重要意義。平菇在我國人工栽培食用菌中產量第一，具有重要的食藥用價值[4]。將食用菌栽培副產物菌糠適當替代日糧粗飼料，有利于提高干物質采食量及營養物質瘤胃降解率[5-6]。目前，利用真菌發酵改善秸稈及菌糠養分利用率的研究頗受關注。龔劍明等[7]將P.chrysosporium等4 種真菌接種油菜秸稈進行固態發酵，發現其常規養分及幾丁質含量顯著提高，且體外發酵有機物降解率不同程度提高。利用白腐真菌處理農作物秸稈可改變其木質素等異質高聚大分子物質結構，顯著提高秸稈瘤胃干物質消失率[8]。劉啟燕等[9]研究發現，金針菇菌糠的纖維含量優于稻草、燕麥草及青貯，用其飼喂奶牛可顯著提升產奶量，在一定程度上發酵菌糠有利于改善奶牛的健康狀況。作為草食動物粗飼料資源，菌糠廣受關注，目前研究主要集中在單一的真菌發酵或直接利用副產物進行飼喂，對不同收菇茬次菌糠的系統研究鮮見報道。本試驗以稻草秸稈（以下簡稱“稻秸”）為主要碳源，輔以麩皮和豆粕混合接種平菇菌株，評價不同收菇次數稻秸平菇菌糠常規養分含量及體外發酵特性，為平菇發酵稻秸技術以及高效利用菌糠資源提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 平菇栽培料接種與制作 平菇菌種由湖南農業大學食用菌工程研究中心提供，稻秸為大通湖區宏碩生態農業農機合作社試驗地種植的水稻（湘兩優900）完熟收割后的剩余秸稈。真菌接種過程參考文獻[10]：將稻秸切至1.5～2.5 cm 長短，在1%（質量體積比）石灰水中浸泡48 h 后瀝干，按稻秸85%、麩皮10% 和豆粕5%（干物質基礎）的比例混合均勻，裝包（1 kg/ 包），栽培料營養成分如表1 所示；滅菌（120～125℃、0.15～0.20 MPa、4 h）后進行接種（1 cm×1 cm×1 cm 平菇塊/包），菌種用量為栽培料質量的5%，在（25±2）℃下進行避光有氧培養。分別在第0、1、2 茬收集菌糠，65℃烘干粉碎后，選用60 目孔篩（250 μm 粒度）進行過篩，用于常規營養成分測定和體外發酵。

1.2 試驗設計 選用3 種平菇真菌六月灰（Oyster Mushroom Liuyuehui，OML）、1676（Oyster Mushroom1676，OM1）和江都71（Oyster Mushroom Jiangdu71，OMJ）分別接種于表1 所示稻秸栽培料基質，接種當天記為第0 天，在菌絲長滿出菇前收集菌糠，記為第0 茬菌糠，當平菇菌蓋基本展開，其顏色呈現淡灰色或灰白色時進行收菇，第1 次收菇后收集菌糠，記為第1 茬，第2 次收菇后收集菌糠，記為第2 茬。共計3×3 個處理，每個處理3 個重復，同時設2 個空白對照樣。各處理組信息見表2。

表2 各菌菇的收菇時間

1.3 體外模擬瘤胃發酵設備 本試驗采用全自動體外模擬瘤胃發酵設備，具體參數設定及使用操作參照Wang等[12]研究。發酵瓶置于恒溫培養箱中，通過導管與三通電磁閥（3V320-08，寧波奉化永利氣動成套有限公司）和壓力傳感器（CYG130-12，昆山雙橋傳感器測控技術有限公司）連接。壓力傳感器對發酵瓶中的壓力進行測定并記錄，根據壓力與氣體體積間的關系計算72 h 氣體生成量。當發酵瓶中壓力到達設定排氣壓力（9 kPa）時，計算機控制電磁閥打開，發酵瓶中的氣體通過導管進入氣相色譜儀（安捷倫 7890A，美國）測定甲烷和氫氣含量，其中甲烷檢測用色譜柱規格（GB3591-80047）：2.44 m×3.175 mm×2 mm，火焰電離檢測器（FID）檢測溫度為300 ℃，載體為N2（流速為30 mL/min）。氫氣檢測用色譜柱規格（GB3591-80047）：1.22 m×3.175 mm×2 mm，熱導檢測器（TCD）檢測溫度為200℃。根據甲烷和氫氣含量、壓力與氣體體積間轉化系數計算甲烷和氫氣產量[13]。

1.4 人工瘤胃液培養液 瘤胃液供體羊選擇3 只體況良好、體重（25.0±2.0）kg 且安裝有永久性瘤胃瘺管的去勢成年湘東黑山羊。飼糧參考《肉羊飼養標準》（NY/T 816-2004），配制精粗比為40:60 的基礎飼糧。稻秸用鍘草機切至2～3 cm 長短，精料經2.5 mm 篩粉碎，基礎日糧配方及營養成分見表3。試驗期內每頭供體羊每天飼喂基礎日糧500 g，每天于08:30 和18:00 飼喂。

表3 基礎日糧組成和營養成分（風干基礎）

人工瘤胃緩沖液：參照Menke 等[14]提供的方法配制2 400 mL 的人工瘤胃緩沖液。向緩沖液中持續通入CO2氣體，加入2.0 mL 刃天青溶液后置于恒溫磁力攪拌器上預熱至39.5℃，保持溶液厭氧環境，直至緩沖液從藍色轉變為近無色即可。

人工瘤胃培養液：試驗當天晨飼前1 h，通過瘤胃瘺管采集供體羊瘤胃液裝入保溫瓶，瘤胃液混合均勻后迅速用4 層脫脂紗布過濾于接收瓶，量取600 mL 過濾液迅速加入到準備好的2 400 mL 人工瘤胃緩沖液中（瘤胃液與緩沖液配比為1:4），期間持續沖入CO2確保厭氧環境，制成人工瘤胃培養液。

1.5 試驗方法

1.5.1 體外模擬瘤胃發酵 稱取0.6 g 底物放入150 mL發酵瓶中，加入60 mL 人工瘤胃培養液，放置于恒溫培養箱（振蕩頻率50 r/min，溫度39.5℃）中預熱。取出發酵瓶，通入CO2保證厭氧環境。依次向每個發酵瓶中加入60 mL 人工瘤胃培養液，并將發酵瓶放回恒溫培養箱中進行體外模擬瘤胃發酵，72 h 后終止發酵。

1.5.2 樣品采集 體外模擬瘤胃發酵，72 h 后終止發酵，取2 mL 發酵液，4℃、15 000 r/min 離心10 min。取1 mL上清液于2 mL 離心管中，加入0.1 mL 25% 偏磷酸固定15 min，-20℃保存，用于總揮發性脂肪酸（TVFA）、氨態氮（NH3-N）測定。將發酵內容物用紗布抽干置于鋁盒中，105℃烘箱中烘8 h，測定干物質降解率（DM Degradability，DMD）。

1.5.3 指標測定 干物質（DM）、CP、NDF、ADF、EE分別按標準（GB/T 6435-2014、GB/T 24318-2009、GB/T 20806-2006、NY/T 1459-2007、GB/T 6433-2006）進行測定，總能（GE）采用氧彈燃燒法測定，用Spectrum 公司SI400 型pH 計測定體外發酵液pH。通過裝有檢測器和HP-INNOwax（30.0 m×320 μm×0.5 μm，Catalog No:19091N-213）毛細管色譜柱的氣相色譜儀（GC-2010；Shimadzu Corporation，Japan）測定VFA。體外發酵濾液采用T/CAAA 003-2018 中的苯酚-次氯酸鈉比色法測定NH3-N 含量。

DMD=（放入發酵瓶前底物重-終止發酵后殘留底物重）/（放入發酵瓶前底物重）×100%

1.6 統計分析 數據經Excel 2010 整理，使用SPSS 24.0 統計軟件中一般線性模型（GLM）的多因素方差分析計算兩因素（品種、茬次）的主效應及交互效應，差異顯著則運用Duncan's 法進行多重比較，結果表示為平均值和標準誤，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 3 種平菇不同收菇茬次對菌糠營養成分的影響 由表4 可知，OML 組的CP 和TDN 含量顯著高于OM1和OMJ 組，且NDF 和ADF 含量顯著低于其他兩組，OMJ 組EE 和GE 含量較高；CP、NDF、ADF 以及TDN 在不同品種、茬次及兩者交互上均具有極顯著效應，且3 組稻秸平菇菌糠NDF 和ADF 含量隨著收菇茬次增加而逐漸降低，說明纖維成分得到有效降解。總體來看，OML 菌糠的營養成分更優。

2.2 3 種平菇不同收菇茬次對菌糠體外發酵的影響 由表5 可知，體外瘤胃發酵試驗中，3 組稻秸平菇菌糠發酵產物各有差異。72 h 總產氣量、甲烷及氫氣產量均表現為OML-0 組顯著高于其他組，且茬次和交互效應為極顯著。在DMD 方面，OM1 和OMJ 組DMD 先減后增，OML 組呈逐漸降低的趨勢，且OML-0 組顯著高于其他組。隨著收菇茬次的增加，OM1 和OMJ 組體外發酵NH3-N 和TVFA 濃度表現為先增后減的趨勢，而OML-0 組NH3-N 和TVFA 濃度分別達到9.80 mg/dL 和74.67 mmol/L，為所有試驗組產量最高值。

2.3 不同稻秸平菇菌糠體外發酵VFA 各組分分析 由表6 可知，OMJ 組乙酸和丙酸比例較OM1 和OML 組更為穩定，OM1 組丙酸比例顯著高于其他兩組，OML組丁酸、異丁酸、戊酸以及異戊酸比例均保持較高水平。OM1 和OML 組乙丙比隨著收菇茬次增加均保持上升的趨勢，OMJ 組差異不顯著，且乙酸、丙酸、丁酸和乙丙比的品種、茬次以及交互效應均達顯著水平。

3 討 論

3.1 不同稻秸平菇菌糠營養成分 菌糠營養成分與食用菌的種類、收茬時期及培養基成分等多種因素有關。本試驗中，3 種平菇菌糠隨收茬時間延長，GE 均出現不同程度減少，這與平菇菌絲體在代謝過程中消耗基質能量進行纖維素降解有關[15]；除OML 品種外，OM1 和OMJ 均表現為第1 茬菌糠CP 含量最高，且相較于栽培料CP 含量提升72% 以上，原因可能是平菇菌糠中部分蛋白質來源于平菇真菌的轉化和生物固氮作用，合成的菌體蛋白質部分殘留菌糠中[16]，隨著發酵時間延長，氮素轉移至菌絲體[17-18]，這與張純等[19]研究結果一致。龔劍明等[7]用不同真菌發酵油菜秸稈，發現養分含量及酶活性存在差異，本研究中OML-0 和OML-2組CP 含量均高于同時期其他2 種平菇菌糠，原因可能是OML 在菌糠中殘留的菌體蛋白較其他2 種平菇更多，其次在平菇栽培過程中，不同時期蛋白酶的活性差異可能影響了菌糠CP 含量。在本試驗中，3 種平菇菌糠隨著收菇茬次的增加，NDF 和ADF 含量顯著下降，在栽培料基礎上降幅分別超過49%和45%，說明平菇真菌發酵可作為一種有效降低稻秸纖維素的手段，其主要機制為食用菌代謝過程中，菌絲體細胞分泌纖維素酶、木質素過氧化酶等胞外酶[20]，通過酶解作用把纖維素等大分子物質分解成單糖等可溶性碳水化合物[21]，降低NDF 和半纖維素含量。這也導致3 種平菇菌糠TDN 隨收茬次數增加而顯著增加，說明適當延長平菇真菌發酵時間有利于提升菌糠相對飼用價值。本研究發現，OML-2 組NDF 和ADF 降解率較栽培料降幅分別達到68%和71%，效果顯著優于OM1 和OMJ，說明不同平菇菌株對纖維素的降解率存在顯著差異，OML 對稻秸的纖維降解能力更強。在干物質降解方面，OM1-1 和OMJ-1 組DMD 低于同品種其他時期，而72 h 總產氣量和TVFA 濃度保持較高水平，這可能與較高的CP 以及適宜的NDF 含量有關，可保證足夠底物供瘤胃微生物發酵，從而提高瘤胃發酵產物含量；另一方面，不同發酵底物的NFC/NDF 也會對瘤胃微生物區系組成產生影響，有研究指出該比例為1.61 時更適合瘤胃發酵[22]。因此，從菌糠營養角度出發，在CP 含量和纖維降解特性方面，OML 品種優于OMJ 和OM1。

表4 不同稻秸平菇菌糠營養成分分析（風干基礎）

3.2 不同稻秸平菇菌糠體外發酵特性 pH 是瘤胃內環境的重要指標，瘤胃微生物繁殖適宜的pH 范圍為6.0～7.0[23]。NH3-N 作為瘤胃氮代謝過程外源及內源含氮物質分解的終產物，是合成微生物蛋白及機體蛋白的主要原料。Owens 等[24]研究指出，瘤胃微生物合成菌體蛋白所需的NH3-N 濃度范圍為0.35～29 mg/dL。本試驗各組體外瘤胃發酵液pH（6.59～6.86）和NH3-N 濃度（5.31～9.80 mg/dL）均位于正常范圍，說明瘤胃發酵液pH 和NH3-N 濃度適合微生物生長和微生物蛋白合成，OM1-1、OMJ-1 和OML-0 組pH 均顯著低于同品種其他時期，而NH3-N 濃度和72 h 總產氣量均顯著高于同品種其他時期，這與營養指標中CP 含量的變化趨勢一致，原因可能是OM1-1、OMJ-1 和OML-0 組菌體代謝活動旺盛，產生更多的菌體蛋白和可溶性碳水化合物，促進瘤胃微生物吸收利用，產生NH3-N 和VFA 等代謝物，從而降低體外發酵液pH[25]。而OML 品種表現為第0 茬NH3-N 濃度顯著高于第1 茬和第2 茬，這與OML-0 組CP 含量顯著高于OML-1 和OML-2 組的結果一致。VFA 可被瘤胃上皮組織以被動擴散形式、VFA和HCO3-陰離子交換以及電介導等轉運途徑，為反芻動物持續提供能量[26]，其中乙酸、丙酸和丁酸約占TVFA的95%。瘤胃中VFA 組分差異與發酵底物碳水化合物組分密切相關，OM1-1、OMJ-1 和OML-0 組TVFA 濃度均顯著高于同品種其他時期，且乙酸、丙酸、丁酸具有增加的趨勢。說明稻秸在發酵過程中，OM1 和OMJ菌糠碳水化合物含量在第1 茬時達到最高，瘤胃微生物代謝產生VFA 含量較多。一般而言，飼糧纖維水平降低有利于乙酸/丙酸比例減小，3 種平菇菌糠都表現為第0 茬NDF 和ADF 含量最高，而OM1-0 和OML-0組乙酸/丙酸比例顯著低于同品種其他時期，OMJ-0 組乙酸/丙酸比例具有顯著降低的趨勢，這與Giger 等[27]的研究結果存在差異，其機理有待進一步研究。

表5 不同稻秸平菇菌糠體外瘤胃發酵特性分析（風干基礎）

碳水化合物在瘤胃發酵伴隨產生氫，從而轉變為氫氣，其中溶解態氫是甲烷菌利用二氧化碳合成甲烷的重要前體物質。本研究發現，OMJ-1 與OML-0 組氫氣、甲烷及72 h 總產氣量顯著高于同品種其他2 茬菌糠，且OM1-1 組氫氣、甲烷及72 h 總產氣量保持在較高水平，說明甲烷菌和其他厭氧真菌對于以上階段菌糠的活性更強，吸收利用率更高，OM1-1、OMJ-1 與OML-0組菌糠中碳水化合物降解較快，從而產生大量氫氣，氫氣的生成速率超過甲烷菌對其消耗速率時，導致氫氣積累且甲烷產量明顯增加[28]。Huang 等[29]報道，用平菇真菌處理稻秸25 d 可改變其氣孔率和比表面積等物理性質，分別提高稻秸對纖維素酶和木聚糖酶吸附量18.8%和58.1%，可促進生物甲烷的生成，處理時間較符合本試驗中OM1-1、OMJ-1、OML-0 組的收茬時期，且甲烷含量顯著高于同品種其他時期。

4 結 論

本試驗結果顯示，不同收菇次數處理的稻秸平菇菌糠中，OM1 和OMJ 菌糠營養成分含量和體外發酵特性變化規律相似，均表現為第1 茬菌糠CP 含量和體外發酵參數較優，而OML 菌糠表現為第0 茬菌糠CP 含量和瘤胃發酵特性優于后兩茬菌糠。整體而言，3 種菌糠隨著收茬次數增加，NDF 和ADF 含量不同程度降低。不同品種稻秸平菇菌糠中，OML-0 組營養物質組成優于同一茬次其他2 種平菇菌糠，VFA 各組分比例更加合理，有利于反芻動物瘤胃微生物繁殖，合成微生物蛋白用于機體組成及生理代謝。本研究結果可為進一步篩選平菇真菌發酵稻秸提供數據支撐，同時降解差異機理有待進一步研究。