布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3 基因克隆測序及表達分析

吳 磊，劉瑞莉，柏學進，劉賢勛，呂娟娟，肖超柱，董雅娟,3*

（1.青島農業大學動物胚胎工程中心，山東青島 266109；2.山東省黑牛繁育工程技術研究中心，山東青島 266109；3.山東布萊凱特黑牛科技股份有限公司，山東淄博 256306）

CREB調節轉錄共激活因子家族（CREB Regulated Transcription Coactivator Family，CRTCs）是由基因組高通量篩選出的一種保守的真核蛋白家族，包含CRTC1、CRTC2、CRTC3 3 個成員。CRTCs家族的卷曲螺旋結構域（Coiled-coil Domain）高度保守，與CREB的堿性亮氨酸拉鏈結構域（Basic Leucine Zipper，bZIP）相結合，調控CREB的轉錄[1]。CRTC1在大腦中主要通過調控腦源性神經營養因子（Brain-derived Neurophic Factor，BDNF）來調節樹突的生長發育和糖代謝過程[2-3]，此外，β-淀粉樣蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）可能通過影響CRTC1的活性來干擾與記憶相關的基因轉錄，從而在神經退行性疾病阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）的發病過程中發揮重要作用[4-5]。CRTC3基因廣泛分布于各組織細胞中，在棕色脂肪中CRTC3 蛋白通過兒茶酚胺信號通路影響脂肪代謝。可見，CREB調節轉錄共激活因子家族參與多種生理調控，對機體生長發育具有重要作用。

本研究以布萊凱特黑牛為研究對象，通過克隆測序檢測其CRTC1、CRTC3基因的CDS 序列，并進行生物信息學分析；運用熒光定量檢測CRTC1、CRTC3基因mRNA 相對表達量；并用免疫組化技術檢測CRTC1、CRTC3 蛋白的表達位點，探討CRTC1、CRTC3基因與肉牛肌肉生長發育的關系，以期為布萊凱特黑牛品種繁育提供基因儲備，并為進一步研究CRTC1、CRTC3基因的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 氨芐、IPTG、X-Gal 購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；T 載體連接試劑盒購自上海生工生物股份有限公司；反轉錄試劑盒購自青島擎科生物有限公司；iTaqUniwersal SYBR Green Supermix 5 mL（5×1 mL Vials）購自青島鑫宇恒一科技有限公司。PCR 儀購自德國Eppendorf 公司；凝膠成像系統購自Alpha Innotech 公司；熒光定量儀購自Bio-Rad 公司；Leica RM2235 切片機購自德國萊卡公司。

1.2 實驗動物與樣品采集 實驗動物來自布萊凱特黑牛科技股份公司，是通過體細胞克隆、胚胎移植等技術培育而成的優良種質[6]。選取飼養環境相同的2、6、10、18 月齡的布萊凱特黑牛和魯西黃牛各3 頭，采集脂肪、睪丸、甲狀腺、肺臟、背最長肌、心臟、胰臟、肝臟、脾臟、腎臟10 種組織置于液氮中保存，采集背最長肌置于4%多聚甲醛中保存。

1.3 布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3基因的克隆測序 根據NCBI 網站上的牛CRTC1（登錄號：XM_010816996.2）、CRTC3（登錄號：XM_010816996.2）基因序列，運用Primer Premier 5.0 設計引物，引物序列如表1 所示。提取黑牛和黃牛背最長肌總RNA，反轉錄成cDNA，檢測OD 值處于1.8～2.0 后，可進行后續實驗。以背最長肌組織cDNA 為模板，依次加入2×T5 Super Mix 12.5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、cDNA模板1 μL，置于離心機中混勻后進行RT-PCR 擴增。瓊脂糖凝膠電泳后將得到的目的片段進行膠回收，并采用T 載體連接試劑盒將目的片段連接到pMD19-T 載體上，轉化并篩選陽性菌落，提取目的基因重組克隆質粒后送至上海生工生物有限公司進行測序。

1.4 布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3基因熒光定量PCR檢測 提取睪丸、肺臟、肝臟、脾臟、腎上腺、甲狀腺、心臟、胰臟、脂肪、背最長肌的cDNA，以及2 月齡、6 月齡、10 月齡、18 月齡背最長肌的cDNA。以cDNA為模板進行熒光定量PCR。選取GAPDH基因（登錄號：NM_001034034.2）為內參基因，根據上述序列設計熒光定量引物（表1），將96 孔板置于冰上，按滴加10 μL SYBR Green 預混液，7.8 μL RNA-free Water，上下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，1 μL cDNA 模板。PCR反應程序：94℃預變性10 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40 個循環。檢測數據采用2-△△CT值法計算。

1.5CRTC2基因免疫組化檢測 取出在4%多聚甲醛中固定的背最長肌進行修剪。在PBS 緩沖液中浸泡10 h，用不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟1 h，待蠟塊完全凝固后對背最長肌進行修整，用切片機切成5 μm厚度。置于58℃烘箱中12 h，取出后再依次用二甲苯、不同濃度的乙醇、枸櫞酸鈉緩沖液浸泡，用PBS 緩沖液沖洗3 次，每次7 min。用濾紙吸凈玻片上的液體，滴加山羊血清，然后置于濕盒中，放在37℃的恒溫箱中靜置30 min。取出后拭去玻片上的血清，滴加一抗，小心置于4℃冰箱中過夜。PBS 緩沖液洗3 次后繼續滴加二抗（辣根過氧化物酶），放置在濕盒中，錫紙包裹后放于37℃恒溫箱中30 min，PBS 緩沖液洗4 次，每次10 min。滴加DAPI，完全覆蓋組織片即可，放在濕盒中，然后置于37℃恒溫箱中靜置5 min。輕甩PBS緩沖液洗4 次，最后用抗熒光衰減封片劑進行封片處理，繼而熒光顯微鏡檢查以及拍片。

表1 引物序列

2 結果

2.1CRTC1、CRTC3基因克隆測序及生物信息學分析 以布萊凱特黑牛背最長肌為模板，克隆測序發現CRTC1、CRTC3基因CDS區分別為1 773 bp和1 725 bp（圖1），分別編碼590、575 個氨基酸，CRTC1 和CRTC3蛋白的總平均親水性分別為-0.577、-0.559，等電點pI分別為5.50 和6.17（表2）。進化樹（圖2）顯示與牛、瘤牛、山羊和綿羊的同源性高（＞80%），二級結構（圖3）顯示CRTC1、CRTC3基因不規則卷曲均高于60%，其次為α-螺旋，并含有少量的β-折疊和β-轉角。蛋白互作網絡圖（圖4）顯示CRTC1、CRTC3基因與鹽誘導激酶、AMPK家族基因、FOXO1、FOXO3、AKT1、AKT2、AKT3、TP53、CITED2、CREBBP、CRTB1、ATF3、IRF3、RELA等基因相互作用。

2.2CRTC1、CRTC3、GAPDH基因的PCR 擴增 由圖5 可知，擴增產物CRTC1、CRTC3、GAPDH基因分別為63、130、104 bp，產物與預期一致，條帶清晰無雜質。

2.3 實時熒光定量PCR 結果 由圖6 可知，布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3、GAPDH基因擴增結果良好，特異性強，無雜亂峰，數據可用于下一步分析。

圖1 布萊凱特黑牛CRTC1（A）、CRTC3（B）基因CDS 擴增產物

表2 CRTC1、CRTC3 蛋白基本性質

圖2 CRTC1（A）、CRTC3（B）cDNA 序列構建的UPGMA 系統發生樹

2.4CRTC1、CRTC3基因在不同組織中的表達分析 由圖7 可知，CRTC1、CRTC3基因在各組織中均有表達，CRTC1基因在睪丸中的mRNA 相對表達量最高，均極顯著高于胰臟、腎上腺、脾臟等其他組織；其次在胰臟中表達，顯著高于胰臟和腎上腺組織，極顯著高于肝臟、甲狀腺等其他組織；在心臟中的表達量最低。CRTC3在脂肪組織中的表達量最高，極顯著高于睪丸、甲狀腺、心臟、肺臟等其他組織；其次在睪丸和甲狀腺中表達，且極顯著高于肺臟、心臟和胰臟等其他組織；在腎臟中表達量最低。

2.5CRTC1、CRTC3基因在不同月齡的表達分析 由圖8 可知，布萊凱特黑牛和魯西黃牛背最長肌CRTC1、CRTC3基因在4 個時期中均有表達，并隨著年齡的增長表達量逐漸降低。布萊凱特黑牛CRTC1基因在2 月齡表達量最高，極顯著高于6、10、18 月齡，在18 月齡表達量最低。CRTC3基因在6 月齡表達量最高，極顯著高于10、18 月齡。魯西黃牛CRTC1基因在2 月齡表達量最高，極顯著高于10、18 月齡，顯著高于6月齡；CRTC3基因在6 月齡表達量最高，高于2 月齡，極顯著高于10、18 月齡。

2.6 CRTC1、CRTC3 蛋白表達分析 由圖9 可知，CRTC1、CRTC3 蛋白在背最長肌中呈區域性分布，主要在肌漿內的肌原纖維中表達，橫切呈橢圓形，縱切呈紡錘形。

3 討 論

圖3 CRTC1（A）、CRTC3（B）蛋白二級結構預測

3.1CRTC1、CRTC3基因CDS 序列分析 本實驗利用普通PCR 法克隆了布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3基因序列，結果顯示，CRTC1、CRTC3基因CDS 區分別為1 773 bp 和1 728 bp，分別編碼575 個和590 個氨基酸，生物信息學分析發現，CRTC1 和CRTC3 蛋白質的不穩定系數分別為63.80 和68.23，均大于40，推斷CRTC1和CRTC3 蛋白質的結構穩定性差。蛋白質的總平均親水性分別為-0.577、-0.559，推斷CRTC1 和CRTC3 蛋白為水溶性蛋白，表現為親水性。CRTC1 和CRTC3 蛋白的等電點pI 分別為5.50 和6.17，均小于7，推斷2種蛋白質都是偏酸性蛋白。二級結構預測顯示，CRTC1和CRTC3 蛋白的不規則卷曲含量最高，其次為α-螺旋，并含有少量的β-折疊和β-轉角，表明該蛋白為非常規蛋白。為揭示CRTC1、CRTC3基因在物種間的親緣關系，本實驗構建了CRTC1、CRTC3基因的系統進化樹，結果發現，布萊凱特黑牛CRTC1、CRTC3基因均顯示與牛、瘤牛、山羊和綿羊相距最近，與野豬、家犬等物種相距較近，與樹袋熊相距最遠。推斷CRTC1、CRTC3基因序列在反芻動物中具有高度的保守性，進而發揮相同的功能。本實驗結果發現，CRTC基因家族與鹽誘導激酶（SIK1、SIK2）、AMPK家族基因（PRKAA1、PRKAA2、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2）、FOXO1、FOXO3等基因互作，在與CRTC1、CRTC3互作的基因中，PRKAA1和PRKAA2是調節肌內脂肪含量、背膘厚和眼肌面積等生長性狀的基因[7-9]，FoxO基因家族通過多種方式調節骨骼肌的生長發育[10-12]。推測CRTC1、CRTC3基因是調控動物肌肉生長發育的候選基因，具體機制有待后續進一步驗證。

圖4 CRTC1（A）、CRTC3（B）蛋白質互作網絡圖

圖5 CRTC1（A）、CRTC3（B）和GAPDH（C）基因PCR 擴增

圖6 CRTC1、CRTC3 和GAPDH 基因熒光定量擴增曲線（A、C）和熔解曲線（B、D）

圖7 CRTC1（A）、CRTC3（B）基因在不同組織的表達水平

圖8 CRTC1（A）、CRTC3（B）基因mRNA 在4 個不同時期的表達水平

圖9 背最長肌中CRTC1（A）、CRTC3（B）蛋白的表達特征

3.2CRTC1、CRTC3基因各組織、年齡分析 qRT-PCR結果顯示，CRTC1基因在睪丸中表達量最高，在胰臟、甲狀腺、脾臟、背最長肌等組織中表達量較高；在心臟中的表達量最低。推測CRTC1基因在睪丸中起較強的調控作用，在背最長肌等其他組織中也發揮一定作用。目前，CRTC1基因除在大腦的機制研究較為清晰外，脊髓水平CREB/CRTC1 信號活化通過啟動其靶基因轉錄在骨癌痛的維持中也發揮重要作用[13]。本實驗發現，CRTC1基因在肌肉組織中也有表達，推測CRTC1在肌肉組織中也發揮一定的調控作用，具體調節機制有待進一步研究。CRTC3基因在脂肪組織中的表達量最高，在背最長肌、肺臟等其他組織中表達量較高；在腎臟中表達量最低。有研究發現，敲除CRTC3基因的小鼠脂肪細胞會變小[14]，與本實驗結果均表明CRTC3基因對脂肪組織具有調控作用。qRT-PCR 結果顯示CRTC3基因在脂肪組織中的表達量高于肌肉組織，這與約克夏豬中的研究結果相一致[15]。Lee 等[15]研究發現CRTC3基因p.V515F 位點的突變影響瘦肉產量、肌肉總面積。也有研究者對牛的CRTC1、CRTC3基因進行了SNP 檢測，發現CRTC1基因單倍型組合H3H3(GGAA)、CRTC3基因單倍型組合H1H1（AACCCCTT）對肉牛的生長性狀和胴體性狀有顯著影響[16]。本實驗亦發現CRTC1、CRTC3基因在肌肉組織中有表達，進而推測CRTC1、CRTC3基因在肌肉組織中發揮一定的調節作用。

肥育期肌肉的發育是影響屠宰牛等級和肉質的一個重要因素，在肥育階段肌肉的生長占主要地位[17]。本研究運用實時熒光定量方法檢測2 個品種4 個不同時期的CRTC1、CRTC3基因mRNA 表達量，結果發現，2個品種的CRTC1、CRTC3基因的mRNA 相對表達量都隨著年齡的增長逐漸降低。有研究者發現，在動物早期階段，肌纖維的生長速度隨著月齡增長逐漸減緩[18]，進而推測CRTC1、CRTC3基因參與肌肉生長發育相關調節。

3.3 CRTC1、CRTC3 蛋白定位 本研究發現，CRTC1、CRTC3 蛋白主要定位于細胞質中，在肌漿內的肌原纖維中表達，預示著CRTC1、CRTC3 蛋白對肌原纖維的生長發育具有調控作用。此外，有研究者發現，肌肉組織中的CRTC3 結合到CREB 增加線粒體中呼吸鏈和三羧酸循環中下游目的基因表達，進而增強了能量代謝[19]。也有研究發現，CRTC3 具有調控小鼠骨骼肌發育和肌纖維重構的作用[20]。這與上述的免疫組化和免疫印跡實驗結果相一致，均表明CRTC1、CRTC3 蛋白在肌肉組織中具有調控肌纖維生長發育的作用。

4 結 論

本研究結果發現，CRTC1、CRTC3基因在布萊凱特黑牛的各組織中均有表達，在背最長肌中的表達隨著月齡的增加表達量逐漸降低，背最長肌中的CRTC1、CRTC3 蛋白在肌原纖維中表達。綜上表明，CRTC1、CRTC3基因調控肌纖維生長發育，進而參與肌肉生長發育相關調節。本研究結果可為布萊凱特黑牛新品種培育提供分子方面理論依據。