利用微衛星標記分析青紫藍獺兔的保種效果

申金鈺，陳 實，趙 斌，李佳麗，盧婷婷，翁巧琴，鮑國連，陳 陽，吳信生*

（1.揚州大學動物科學技術學院，農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，江蘇揚州 225009；2.浙江省余姚市欣農兔業有限公司，浙江寧波 315400；3.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，浙江杭州 310021）

獺兔，又名力克斯兔，意為“兔中之王”，是皮肉兼用型兔，因其皮毛酷似珍貴的毛皮獸水獺而得名。獺兔具有外貌勻稱，耳朵長，須眉卷曲，毛絨短、平、密、細、美、牢等特征[1-2]，其毛色天然純正，手感柔軟滑爽，在國際、國內市場上銷售前景廣闊，特別是青紫藍獺兔，被毛為藍灰色，吹開被毛呈現彩色輪狀漩渦，十分美觀，頗受消費者青睞[3-4]。我國現存的青紫藍獺兔數量甚少，本團隊經過長期進行遺傳資源的搜集與選育工作，已經建立了青紫藍獺兔的資源群體，為本研究的開展提供了研究素材[5-6]。

分子標記技術誕生于20 世紀80 年代，實現了從表型選擇到基因型選擇的飛躍。其中由liit 和luty 命名的微衛星標記具有分布均勻、保守性高、多態性豐富、突變率較低、簡易性、呈共顯性遺傳特點，目前在家兔的遺傳多樣性評估上已有一些應用。朱玉峰等[7]利用微衛星標記等分析Vc 獺兔的群體遺傳結構和遺傳穩定性。申幸嬌等[8]采用18 個微衛星位點（Sat2、Sat5、Sat8、Sat12、Sol33、Sol44、6L1F10 等）檢測國內日本大耳白兔、青紫藍兔等的遺傳背景及遺傳結構，研究表明這18 個微衛星位點遺傳多樣性較高，種群間分化明顯。微衛星標記已被廣泛應用于家兔遺傳育種，但其在家兔分子研究中應用較少，尚無實質性突破。相對于國外的家兔領域研究，微衛星標記的推廣起步晚，研究也較淺。目前我國彩色獺兔數量少，品種質量差，毛色遺傳不穩定等，很難形成高規格批量供貨，成為我國彩色獺兔發展的主要限制因素。本研究基于已有的青紫藍獺兔資源群體，研究多個世代保種后的群體遺傳多樣性的變化，篩選出23 個微衛星位點，分別統計1、4、5 世代的遺傳多樣性參數，建立起青紫藍獺兔保種選育的數據庫。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗取用青紫藍獺兔3 個世代的耳組織樣，分別選取1、4、5 世代獺兔群體，每代各取60 只，共計180 只，所采耳組織樣均來源于余姚欣農兔業有限公司。

1.2 實驗試劑與儀器

1.2.1 實驗試劑 總RNA 提取試劑盒（DP419），購于天根生化科技（北京）有限公司；Tris 飽和酚、異丙醇均購于北京鼎國生物技術公司；瓊脂糖購于SIGMA 有限責任公司；脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA 聚合酶均購于Invitrogen 有限責任公司；Tris base、DL2000、SDS、EDTA、去離子甲酰胺、硝酸銀、亞甲基雙丙烯酰胺等均購于上海生物工程有限責任公司。

1.2.2 實驗儀器 ND-1000 濃度測定儀、BD-255LTB型低溫冷凍柜、制冰機、Eppendorf 移液槍、DYCZ-21 型電泳槽、AB1-3730XL DNA Analyzer 測序儀、小型Eppendorf AG-22331Mini 式高速離心機、電泳槽DYCZ-24A、Image Quant Capture3000 成像系統、DK-600 型電熱恒溫水槽、高壓滅菌鍋、Eppendorff Centr5ge5415R 冷凍離心機等。

1.3 實驗方法

1.3.1 青紫藍獺兔耳樣采集 用剪刀取1 cm3兔耳組織，放入1.5 mL 離心管中，置于-20℃下冷凍保存、備用。

1.3.2 青紫藍獺兔基因組DNA 提取 根據試劑盒操作說明來提取青紫藍獺兔基因組總DNA。DNA 提取后，用NanodropND-1000 全波長的分光光度計測定溶解后原液的DNA 濃度，根據測定結果取部分原液統一稀釋至100 ng/ L，4℃保存備用，剩余原液置-20℃保存。

1.3.3 篩選微衛星引物及PCR 擴增 查閱相關參考文獻[9-12]發現SSR 標記位點數較少，本實驗從中篩選23 個具有代表性的SSR 標記位點，分別分布在19 個不同染色體上，由上海生工生物技術服務有限責任公司合成引物。PCR 反應程序為在冰浴中，將PCR 所需成分依次加入無菌0.5 mL 離心管。調整PCR 儀反應程序，將上述混合液稍加離心，立即置于PCR 儀進行擴增。PCR 擴增程序：95℃預變性5 min，94℃變性45 s，50～64℃退火40 s（因位點而異），72℃延伸40 s，共34 個循環，72℃延伸l0 min 至4℃保存。PCR 反應總體系為20 μL：l0×PCR（Mg2+free）Buffer 2 μL，25 mmol/L MgC120.8～1.2 μL，2.5 mmol/L dNTPs l.0 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，Taq DNA 聚合酶1.0 U，100 ng/μL DNA 模板1.0 μL，雙蒸水補至20 μL。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR 擴增產物進行檢測，從而篩選出符合條件的引物。

1.3.4 熒光標記引物PCR 擴增 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）得到青紫藍獺兔基因型圖，根據GenBank數據庫公布的微衛星位點目的片段長度，以等位基因大小為參數，當產物相差20 bp 以上，在測序時等位基因片段長度區別比較大，信號容易區分，因此把相差20 bp 以上的SSR 位點進行組合，每3 個位點一組；用FAM（藍色）、TAMRA（黃色）、HEX（綠色）3 種熒光染料分別對上游引物5’端進行熒光標記，共計15個標記組合，由上海生工生物技術服務有限責任公司進行合成（表1）。對23 個熒光SSR 標記引物進行單一PCR 擴增處理后，再對不同的PCR 產物混合樣進行STR 分型檢測，獲得STR 電泳圖譜。

1.3.5 統計分析 使用微衛星序列分析軟件Genemapper 4.0，選擇Microsatellite 為分析方法，建立Genemapper分析項目，導入獺兔混合樣的電泳結果進行數據分析，分析完成后導出每個微衛星位點的峰圖，根據每個樣本的測序圖譜結果自動連續地讀出對應的擴增產物濃度、片段大小等數據，通過峰圖判斷同一位點上的2 個等位基因是否相同，單峰表示相同，代表純合子，雙峰表示雜合子，用Excel 表記錄每個位點的不同樣本峰圖，青紫藍獺兔第1 世代的23 個SSR 位點在個體中的分布位置；利用PopGene 軟件對青紫藍獺兔各遺傳多樣性參數進行統計分析；采用SPSS 20.0 軟件進行不同世代青紫藍獺兔各遺傳多樣性參數分析，具體包括等位基因數（A）、有效等位基因數（Ae）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Obs He）和多態信息含量（PIC），以P＜0.05 作為差異顯著標準。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取及PCR 產物結果檢測 提取青紫藍獺兔全基因組DNA，使用Nanodrop ND-1000 濃度測定儀測定所提取DNA 的純度和濃度，并記錄數據。此外，檢驗所得的PCR 擴增產物與預期結果一致，約為250 bp。

2.2 SSR 熒光標記毛細管電泳檢測 檢測結果表明等位基因的片段長度在88～456 bp，均小于500 bp（圖1）。圖1 是INRACCDDV0313（HEX）、6L2H3（FAM）和INRACCDDV0309（TAMRA）3 個SSR 位點的毛細管凝膠電泳結果。

2.3 3 個世代的遺傳多樣性分析 由表2 可知，青紫藍獺兔3 個世代的A 分別為3.173 9、3.087 0 和3.173 9，Ae 分別為2.104 3、1.984 7 和1.877 1，遺傳多樣性較為豐富。1 世代Obs He 為0.517 4（Obs He＞0.5），遺傳變異程度較高，表明兔群對環境的適應能力強；3 個世代的PIC 在0.357 4～0.387 8，呈中度多態，說明兔

群遺傳變異程度較高，其中多態性最高的是1 世代，多態性最低的是5 世代。各世代保種群Obs He 較高，均在0.493 5～0.542 0。其中4 世代保種群Obs He 最高，5 世代保種群最低，但3 個世代之間無顯著差異。

表1 熒光標記SSR 引物23 個位點組合及反應條件

圖1 SSR 位點毛細管凝膠電泳結果

青紫藍獺兔3 個世代的各遺傳參數差異不顯著，浙江余姚保種場的保種效果良好。

表2 23 個微衛星位點下青紫藍獺兔3 個世代各遺傳多樣性參數統計

3 討 論

家兔保種是指保存一切與特定生態條件相聯系的基因及基因組合體系，使家兔品種基因庫中的每一優良基因都不丟失。家兔品種保存方法包括凍精、凍胚和活畜相結合等，目前以活畜保種為主。通過基因庫活體保存技術對優良家兔種質資源集中保存備份，以便利用基因庫開展相關研究。

本研究利用篩選出的23 個SSR 位點組合對青紫藍獺兔基因庫保種群體的遺傳變異情況進行相關檢測，可為日后在家兔保種領域的研究提供一定依據。遺傳多樣性一般指種內個體間或一個群體內不同個體的遺傳變異總和。Ae 反映某等位基因分布的均勻程度，其數值越接近所檢測到的等位基因的絕對數，表明等位基因在群體中分布越均勻[13]。雜合度即基因的多樣性。群體雜合度（Heterozygosity）指隨機抽取的2 個樣本的等位基因不相同的概率，可作為檢測品種遺傳變異的指標[14-15]。PIC 表示一個后代所獲得某個等位標記來自于父親（或母親）的同一個等位標記的可能性，是表示DNA 變異程度高低的一個指標。高度多態位點PIC 在0.5 以上，中度多態位點PIC 在0.25～0.5，低度多態位點PIC 低于0.5。

很多學者基于相關原理對群體間的遺傳變異情況進行判斷。陳民利等[16]對大耳白黑眼兔封閉群與日本大耳白兔、新西蘭兔的微衛星多態性進行對比，發現了區分大耳白黑眼兔與其他品系的特有等位基因。俞春英等[17]檢測了25 只福建黃兔在15 個微衛星位點上的遺傳變異情況，比較Ae、He 和PIC 等遺傳參數，對福建黃兔遺傳多態性進行了分析。謝喜平等[18]選擇了16個微衛星標記，統計了Ae、PIC、He 等遺傳參數，從DNA 分子水平揭示了福建黃兔群體遺傳多樣性和遺傳結構。目前國內對青紫藍獺兔保種效果相關的微衛星標記研究較少，本研究選擇了23 個微衛星位點研究青紫藍獺兔的遺傳多樣性，表明了青紫藍獺兔群體的遺傳多樣性較為豐富，3 個世代之間無顯著差異。此外，實驗還需擴大樣本量，進一步提高樣本的代表性及各遺傳多樣性參數穩定性。

4 結 論

本研究使用的23 個微衛星位點（So144、12L4A1、6L1F10、6L3F8、D3Utr2、7L1B10、19L1C5、So133、So103、12LIE11、L8B5、D7Utr5、So162、Sat2、INRA CCDDV0007、INRACCDDV0087、INRACCDDV0185、INRACCDDV0190、INRACCDDV0192、INRACCDDV 0256、INRACCDDV0346、INRACCDDV0160、INRACCDDV0157）具有中度多態性，可用作遺傳多樣性分析有效遺傳標記，兔群3 個世代的Obs He 都高于He，均在0.5 左右，表明青紫藍獺兔群體有較豐富的遺傳多樣性，同時，浙江余姚欣農兔業有限公司的保種模式和方案得當，保種效果良好。