Cry1 基因在雄性綿羊生殖軸系的表達與定位

王守法，趙淑琴，劉彩萍，張彩霞，韓 樂，祝莉萍，汪瑞龍

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農業大學基礎實驗教學中心，甘肅蘭州 730070）

已有研究表明，Cry1 蛋白在人和小鼠的垂體、肝臟、性腺等組織中廣泛表達[8]。羅萬偉等[9]研究發現，Cry基因在不同年齡段的綿羊垂體中均有表達。Cry1 蛋白在30 日齡牦牛睪丸中的表達量最低，隨著年齡的增長表達量逐漸增高[10-11]。研究哺乳動物生物鐘節律基因的表達對分析動物的季節性發情意義重大。但目前對Cry1 蛋白在綿羊生殖軸系中表達定位的報道較少。本實驗對發情期綿羊生殖軸系中Cry1 蛋白的表達進行了研究，對Cry 蛋白進行生物信息學分析，為分析動物繁殖與生物鐘之間的聯系提供了重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 樣品采自于甘肅省蘭州市小西湖屠宰場，選健康成年雄性綿羊6 頭，頸部放血致死，采集松果體、下丘腦、垂體、睪丸和附睪組織，將這些組織分成2 份，一份置于液氮中保存，另一份置于10% 的福爾馬林中保存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 免疫組化實驗所用到的抗體：一抗rabbit anti-CRY1，二抗Affinipure goat anti-rabbit IgG、rabbit anti-β-actin、免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物公司；RNA 提取試劑盒、蛋白Marker、cDNA 反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；高效RIPA 裂解液（組織/細胞）、Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶公司。

1.2.2 儀器 AO-820 組織切片機（Reichert，美國）；HI1210 攤片機（徠卡，上海）；實時熒光定量PCR 儀LightCycler96（Roche，瑞士）；微型垂直電泳槽、電轉印槽（伯樂公司，美國）；DP71 顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 Quantitative RT-PCR 反應 各組織中RNA 的提取嚴格按照RNA 提取試劑盒說明書進行操作，并用超微量核酸蛋白測定儀測定RNA 濃度，用0.1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。反轉錄嚴格按照cDNA反轉錄試劑盒說明書進行操作，合成cDNA 鏈，保存于-20℃冰箱備用。所用引物設計參考羅萬偉等[9]，其序列號為Cry1（NM_001129735）、內參基因GAPDH（NM_001190390）。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

計算完畢后，比較竣工和設計標高差異值。其中在公式（2）中的可以直接作為實際施工立模標高。正向分析法主要是按照實際施工的步驟順序進行橋梁施工數據的分析測算，合理解決了傳統的倒裝分析法不可避免的橋梁連續施工混凝土收縮不變的計算問題[3]。假設在實際計算過程中，橋梁施工單位在第一階段應力并沒有通過，也可以及時進行調整。此外，正向分析法可以充分考慮設計資料和相應施工方案，對橋梁結構工程、施工工作以及后續的工程監管融為一體，保證監管工作的現實性和針對性。

表1 引物序列

以cDNA 為模板，qPCR 反應總體系為20 μL：模板1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMII 10 μL，0.05 μmol/μL上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。每個樣品設3 個重復。擴增條件為94℃預變性5 min；94℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，循環次數45 次[12-13]。所得相關數據用2-ΔΔCt方法進行計算，每個基因相對表達量均以內參基因為基準進行校正。qPCR 結果用3 次重復實驗“平均值±標準誤”表示（X±SEM），所有數據用SPSS 18.0 軟件進行One-way ANOVA 顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，用GraphPad Prism 5 作圖。

1.3.2 用免疫組織化學定位方法檢測蛋白分布 參照Lincoln 等[14]的免疫組織化學法，檢測Cry1 蛋白在各組織中的表達定位，具體步驟如下：將常規石蠟切片65℃烤片1 h 后進行脫蠟處理，之后用PBS 洗3 次，每次5 min。再將切片置于枸櫞酸緩沖液中高壓修復1 min，自然晾至室溫后用PBS 洗3 次，每次3 min。用3%H2O2濕盒孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶的活性，用PBS沖洗5 min。滴加封閉液，室溫濕盒孵育30 min，傾去。滴加anti-Cry1 一抗，稀釋比例為1:400，對照組用PBS代替。4 ℃濕盒孵育過夜。PBS 洗3 次，每次3 min。滴加二抗，不需要稀釋，室溫濕盒孵育60 min，PBS洗3 次，每次5 min。滴加1 滴DAB 工作液進行顯色，顯微鏡下控制反應時間，約5 min，用蒸餾水終止反應。蘇木精復染5～8 min（時間視顯微鏡觀察結果來定），0.1% HCl 分化，自來水沖洗，切片經梯度酒精脫水干燥后二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后用Olympus DP71 顯微鏡觀察并照相。

1.3.3 Western blotting 分析 將組織用液氮研磨成糊狀后，稱取20 mg 加入250 μL 蛋白裂解液，用渦旋混勻器混勻后，10 000 r/min 4℃離心15 min，取上清[15]，用Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒對上清中的蛋白含量進行檢測，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。剩余蛋白上清分裝后凍存至-80℃冰箱中。

Western blotting 步驟參照文獻報道的方法進行[16]。分離膠濃度為10%，蛋白上樣量為30 μg，相應的一抗（按1:1 000 的比例溶解于含5%脫脂奶粉的TBST 溶液）4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶（HRP）標記相應的二抗（按1:8 000 的比例溶解于含5% 脫脂奶粉的TBST 溶液）室溫孵育2 h。用PBS 在搖床上洗滌2 h，中間多次更換PBS。用高靈敏度化學發光液ECL 檢測試劑盒顯影結果，用X 膠片曝光并進行拍照。

1.3.4 生物信息學分析 登錄表2 所列網址[17-19]，在序列搜索欄中輸入從NCBI 獲取的Cry1 蛋白質序列（XP_012014825.2），對蛋白質理化性質、親水性、信號肽、跨膜結構、結構域、磷酸化位點、糖基化位點、亞細胞定位、二級拓撲結構、三級結構和蛋白的同源性進化分析等作出預測。

2 結果與分析

2.1Cry基因在雄性綿羊生殖軸系各組織的定量檢測qPCR 結果顯示，雄性綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1基因的表達。Cry基因在下丘腦中的表達最高，其次為睪丸，在垂體中表達最少。以垂體為參照，各組織中Cry1基因的相對含量與垂體相比差異顯著（圖1-a）。Western blotting 結果印證了qPCR 結果，Cry1 蛋白在整個生殖軸系均有表達，在下丘腦中的表達最高（圖1-b）。

2.2 Cry1 蛋白在雄性綿羊生殖軸系各組織中的表達HE 染色結果顯示，雄性綿羊各組織細胞形態正常，為健康動物（圖2-a1～e1）。免疫組化實驗結果顯示，對照組背景都為藍色陰性（圖2-a2～e2），anti-Cry1 實驗組在各個組織中均出現免疫反應陽性產物（黃色或棕色）。在松果體中，松果體細胞占細胞總數的90%左右，其余主要為神經膠質細胞。anti-Cry1 實驗組顯示Cry1蛋白在松果體中呈彌散性表達，細胞核、細胞質和細胞膜均呈陽性表達，且著色較深（圖2-a3）。在下丘腦中，胞體呈不規則的圓形、卵圓形、梭形、三角形和多角形等。實驗組免疫反應陽性神經元呈深淺不等的棕黃色，胞核、胞質和胞膜均呈陽性反應（圖2-b3）。在垂體結節部中，anti-Cry1 主要在縱形毛細血管及索狀縱向排列于血管間的腺細胞表達（圖2-c3）。睪丸組織切片經免疫組化染色后，免疫陽性物質均主要分布在睪丸的基膜和間質細胞中（圖2-d3）。在附睪上，管腔上皮細胞、管周肌樣細胞和腔面精子呈陽性表達（圖2-e3）。結果顯示在下丘腦-垂體-性腺軸上都有Cry1 蛋白的存在，暗示生物鐘基因在動物的繁殖發育上發揮重要作用。

表2 生物信息學分析登錄網址

圖1 Cry1 基因在雄性綿羊生殖軸系各組織的定量檢測

圖2 Cry 蛋白的免疫組化結果

2.3 生物信息學分析

2.3.1 Cry1 蛋白理化性質及親水性分析 使用Protparam在線軟件預測Cry1 蛋白的理化性質，結果顯示Cry1 蛋白由587 個氨基酸組成，分子量為66.4 kDa，理論等電點是8.27，半衰期是30 h，消光系數（280 nm）是124 175，肽鏈N 端是蛋氨酸，為不穩定蛋白，脂肪系數是79.78。

使用ProtScale 在線軟件預測Cry1 蛋白的親水性，預測結果如圖3 所示，0 值以上用來表示疏水區，該區段的分值越高則表示所測蛋白的疏水性越強，0 值以下用來表示親水區，該區段的分值越低，則表示所測蛋白的親水性越強。Cry1（-0.391）為親水性蛋白質。

圖3 Cry1 蛋白親水性分析

2.3.2 蛋白質磷酸化位點及糖基化位點預測 使用NetPhos 3.1在線軟件預測Cry1 蛋白磷酸化位點，結果如圖4 所示，Cry1 蛋白的氨基酸序列上存在53 個磷酸化位點，其中位于絲氨酸（Ser）的有33 個，位于蘇氨酸（Thr）的有14 個，位于酪氨酸（Tyr）的有6 個。Cry1 蛋白的糖基化位點有23 個。

圖4 Cry1 蛋白的磷酸化位點預測

2.3.3 蛋白質信號肽、跨膜域及二級拓撲結構分析 通過預測發現Cry1 蛋白無信號肽信息，表明該蛋白不是分泌蛋白，且Cry1 蛋白不存在跨膜結構。Cry1 蛋白二級結構元件有α螺旋229 個（39.08%）、無規卷曲258個（44.03%）、伸展鏈63 個（10.75%）、β-轉角36個（6.14%）。

2.3.4 Cry1 蛋白的亞細胞定位及蛋白保守結構域預測Cry1 蛋白主要位于細胞質（52.2%）、細胞核（21.7%）、分泌囊泡（4.3%）、細胞骨架（4.3%）。Cry1 蛋白含有1 個DNA 裂解酶的FAD 結構域，存在于288～486位氨基酸；還有1 個PhrB 超家族結構域，存在于6～491 位氨基酸（圖5）。

圖5 Cry1 蛋白保守結構域分析

2.3.5 Cry1 蛋白三級結構預測 Cry1 蛋白建模模板為4k0r.1.A，其相似性為95.90%，可信度為97.62%（圖6）。

圖6 Cry1 蛋白三級結構預測

2.3.6 不同物種Cry1 蛋白的進化分析 通過同源性比對分析發現（圖7），與羊的Cry1 氨基酸序列最為相近的動物是牛，同源性為99.1%，之后依次為鹿（98.6%）、豬（98.1%）、狗（98.0%）、貓（97.7%）、馬（97.2%）、鼠（95.4%）、雞（92.5%）、人（90.3%）。由圖8 可見，綿羊的Cry1 氨基酸序列與牛和鹿最為接近。

3 討 論

通過qPCR 和Western blotting 實驗顯示，雄性綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1基因的表達，因此暗示Cry基因通過下丘腦-垂體-性腺軸參與哺乳動物生殖調控。Cry1在下丘腦中的表達最高，但這一結果與高磊等[20]在綿羊性腺軸上Cry基因表達的結果不相符，其結果為松果體中Cry基因的表達量明顯比其他組織的表達量高。但本研究結果與生物鐘基因主要存在于下丘腦的視交叉上核的結果相印證[1]。

圖7 Cry1 氨基酸序列的同源性比對

圖8 Cry1 氨基酸序列的系統進化樹

通過免疫組織化學實驗結果表明，Cry 蛋白在雄性綿羊松果體及生殖軸系中均廣泛表達，與qPCR 的結果相一致。在松果體和下丘腦中，Cry 蛋白成彌散性表達，胞膜、胞質及胞核均有陽性表達。在垂體上Cry 蛋白主要位于毛細血管的管壁細胞和血管周圍的腺細胞上，這說明血液中的某些成分對Cry 蛋白有很大影響。在睪丸上，Cry 蛋白主要位于睪丸的基膜和間質細胞。在附睪上，Cry1 蛋白在管腔上皮細胞、管周肌樣細胞和腔面精子上呈陽性表達，這說明Cry 蛋白在精子經過附睪的過程中，對其發育成熟發揮較大作用。有研究表明，與正常小鼠相比，Cry1基因敲除小鼠的精細胞發生改變，凋亡數目明顯增加，數量明顯減少，但血清睪酮濃度改變不明顯[21]。Bur 等[22]證明了Cry1和Cry2作為晝夜節律鐘的組成部分，對于維持雌性和雄性小鼠的性別二型性是必要的，具體來說，雙突變體Cry1-/-Cry2-/-雄鼠不能按需表達雄激素，其性激素水平與雌鼠相似，同時敲除Cry1與Cry2基因小鼠的生物鐘節律則完全喪失。

通過生物信息學分析發現，Cry 蛋白為堿性蛋白質，為親水性蛋白質，無信號肽信息和跨膜結構，主要的二級結構元件是α 螺旋和無規卷曲。亞細胞定位結果顯示Cry1 蛋白主要位于細胞質和細胞核中。構建系統進化樹發現綿羊的Cry1 蛋白與牛、鹿的分子進化距離最近，說明其親緣關系最為密切。蛋白質的結構決定功能[23-24]。為保證預測分析的準確性，本實驗采用了多種分析軟件，雖然各種軟件的原理和算法有所不同，但是結果的相似性極高，說明預測結果具有較高的可信度。

有文獻報道[25]，只敲除小鼠的Cry1基因，或者只敲除小鼠Cry2基因，小鼠的生物鐘節律沒有被損壞，并且小鼠的SCN 核團依然維持著完整的轉錄-翻譯負反饋環路。敲除Cry1基因后，小鼠不論在行為水平還是在主時鐘的調控水平上表現出的生物鐘節律為短周期。敲除Cry2基因后，小鼠的生物鐘節律表現為長周期。如果同時敲除Cry1基因與Cry2基因，小鼠的生物鐘節律則完全喪失[25]。研究還發現在細胞中過表達Cry基因后，其翻譯出的Cry 蛋白增多，CLOCK 和BMAL1 異二聚體的轉錄活性會被Cry 蛋白抑制[26]。可見，Cry1基因對生物鐘的穩定性發揮著至關重要的作用。本實驗成功得出Cry1基因在雄性綿羊生殖軸各組織中均有表達，在下丘腦中的表達最高，睪丸次之，在睪丸組織的基膜和間質細胞，以及附睪管腔上皮細胞、管周肌樣細胞和腔面精子上呈陽性表達。

4 結 論

本實驗結果顯示，在綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1的表達，下丘腦表達最多，暗示作為生物鐘基因之一的Cry1參與了哺乳動物的生殖調控，為生物鐘調控哺乳動物的季節性繁殖提供了一定的研究基礎。