豬脂肪沉積相關酶基因表達與胴體及肉質性狀的相關性研究

郭 勇，張 雄，史開志，陳大軍，黃明捷，莫先艇，王天松，張 勇*

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；3.貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所，貴州貴陽 550005；4.赫章九龍農業旅游開發有限公司，貴州赫章 553200）

豬肉的口感受遺傳、營養、屠宰和加工工藝等多種因素影響，量化為肌肉pH、肉色、肌內脂肪（Intramuscular Fat，IMF）、肌肉水分、嫩度、多汁性、風味評分等指標，其中IMF 含量的高低往往能影響人們對肉產品的選擇，國外品種經過多年選育，其IMF含量仍不及多個國內地方豬種[1]。研究表明，脂肪沉積包括脂肪的合成、轉運和分解等過程，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliFerator-activated receptorγ，PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）和乙酰輔酶A 羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）是參與合成脂肪的關鍵酶，脂肪甘油三酯脂酶（Adipose triglyceride lipase,ATGL）屬于脂解酶，均為對動物脂肪沉積具有調控作用的重要基因[2-5]。豬脂肪細胞有前體脂肪細胞和成熟脂肪細胞2 種類型，前體脂肪細胞由PPARγ等早期轉錄因子調控分化為成熟脂肪細胞，脂肪的存在形式主要是甘油三酯，由脂肪酸被組織酯化合成，脂肪酸可由攝入體內的葡萄糖在ACC 等酶的作用下所轉化，或是血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白所攜帶的甘油三酯被LPL 分解成甘油和脂肪酸[6-8]。ATGL是參與脂肪代謝的重要酶之一，其將脂肪組織中甘油三酯水解以調控細胞中脂肪酸與甘油的平衡[9]。

柯樂豬作為貴州省優質地方豬種，屬于烏金豬支系，具有中等偏大體型，較大且呈漏斗狀的腹部，具有抗病力和抗逆性較強的特點，能較好地適應貴州喀斯特地區濕冷復雜的養殖環境[10]。野柯F1代豬已于2017年注冊為“夜郎黃金豬”商標，以黃毛系柯樂豬為母本、野豬為父本，其雜交后毛色呈金黃色，肉品質優良，具有耐粗飼、耐牧、肉質鮮香、低背膘厚等特點。本研究選用柯樂豬×野豬F1代雜交豬作為研究對象，通過測定其胴體及肉質性狀指標，并與脂肪沉積相關酶基因的表達水平進行關聯分析，以期為柯野雜交豬脂肪沉積效應遺傳分析提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機選取5 頭全同胞柯樂豬×野豬F1代，于赫章九龍農業旅游開發有限公司夜郎黃金豬養殖場飼養至10 月齡。宰前禁食12 h，屠宰后取背最長肌和皮下脂肪組織樣品，凍存于液氮中帶回實驗室，于-80℃冷凍保存。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol 購自（大連）寶生物公司；逆轉錄試劑盒（Thermo ScientiFic RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis）、熒光染料（2×RealStar Green Fast Mixture with ROX）購自貴州西寶生物公司；核酸染料、無酶水（RNase-Free water）、無水乙醇、異丙醇、DL2000 DNA marker 等均購自北京鼎國生物技術有限公司。電子天平購自德國賽多利斯公司；游標卡尺購自日本三豐（mitutoyo）公司；C-LM3B 型數顯嫩度儀購自北京天翔飛域儀器設備有限公司；CR-400 型色差儀購自日本柯尼卡美能達公司；Soxtec2055 型全自動索氏抽提儀購自丹麥福斯公司；CFX96 實時定量PCR 儀購自Bio-Rad 公司。

1.3 測定指標 各項胴體、肉質性狀指標參照中華人民共和國農業行業標準《瘦肉型豬胴體性狀測定技術規范》（NY/T 825-2004）、《豬肌肉品質測定技術規范》（NY/T 821-2004）進行測定。

1.4 總RNA 的提取及cDNA 的逆轉錄 通過Trizol 法提取背最長肌和皮下脂肪組織RNA，并通過紫外分光光度計檢測其濃度和OD 值。參照逆轉錄試劑盒對RNA 進行逆轉錄，將合成后的cDNA 置于-20℃備用。

1.5 引物設計 參考GenBank 上豬（Sus scroFa）PPARγ、LPL、ACC、ATGL、GAPDH基因序列，使用Primer 5.0軟件進行引物設計，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，基因引物序列見表1。

表1 PPARγ、LPL、ACC、ATGL、GAPDH 基因序列

1.6 實時熒光定量PCR 反應 使用Bio-Rad 公司CFX96 實時定量PCR 儀進行定量分析，以GAPDH 基因作為內參，對單個樣品設置3 個重復。實時熒光定量體系采用20 μL：2×RealStar Green Fast Mixture with ROX 10 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、cDNA模板1 μL、RNase-Free H2O 8 μL。反應條件采用兩步法PCR 擴增標準程序：95℃預變性2 min，95℃變性15 s、退火30 s、72℃延伸30 s 共35 個循環，72℃終延伸2 min。

1.7 統計分析 運用Excel 2016 軟件對各組織中目的基因和內參基因mRNA 表達量進行處理，運用2-ΔΔCt法計算，結果以平均數± 標準差表示；運用SPSS 26.0軟件中Pearson 方法檢測背最長肌和皮下脂肪組織中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表達量與胴體肉質性狀指標間相關性；通過STRING 在線網站（https://string-db.org/）對各蛋白互作關系進行預測。

2 結果與分析

2.1 胴體肉質測定 由表2 可知，柯樂豬×野豬F1代肉質指標中，肌肉水分為71.67 %、肌內脂肪為3.26%、皮厚為3.83 mm、背膘厚為39.30 mm、眼肌面積為37.12 cm2。

表2 柯樂豬×野豬F1代的胴體肉質性狀

2.2 胴體肉質性狀相關性分析 由表3 可知，柯樂豬×野豬F1代pH1h與L*、a*和b*呈現出顯著負相關（r=-0.926；r=-0.941；r=-0.929，）；肌肉水分與肌內脂肪間呈顯著負相關（r=-0.911）；背膘厚與眼肌面積間呈顯著負相關（r=-0.896）。

表3 胴體指標、肉質性狀之間的相關性

2.3 常規PCR 擴增結果 利用普通PCR 方法進行目的基因片段和內參基因片段擴增，并經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖1 可知，PPARγ、LPL、ACC、ATGL和GAPDH引物PCR 擴增產物長度及目的片段與預期片段大小相符，電泳條帶清晰、無拖尾、拖帶現象，cDNA 和引物可用作后續實驗。

圖1 PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.4 背最長肌和皮下脂肪組織中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表達水平 由圖2 可知，ACC基因在背最長肌中相對表達量最高，顯著高于ATGL基因，其次為LPL基因；在皮下脂肪中相對表達量最高的為PPARγ基因，其次為ACC基因，LPL基因表達最低。

圖2 背最長肌（A）和皮下脂肪組織（B）中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表達水平

2.5 背最長肌組織中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表達量間相關性 由表4 可知，在背最長肌組織中4 個目的基因間兩兩均為正相關關系，其中，PPARγ與LPL基因mRNA 表達量呈現出顯著正相關（r=0.890）；LPL 與ACC基因mRNA 表達量呈現出顯著正相關（r=0.959）。

表4 背最長肌中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表達量的相關系數

2.6 皮下脂肪組織中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表達量的相關性 由表5 可知，皮下脂肪組織中PPARγ與LPL基因呈負相關，與ACC、ATGL基因mRNA 表達量呈正相關，其中，與ACC基因間呈顯著正相關（r=0.887）。

表5 皮下脂肪中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表達量的相關系數

2.7 背最長肌和皮下脂肪組織中各基因mRNA 表達量與胴體肉質性狀之間的相關性 由表6 可知，背最長肌組織中4 個基因mRNA 表達量均與肌內脂肪、皮厚和背膘厚呈正相關，與滴水損失、熟肉率、剪切力、肌肉水分和眼肌面積呈負相關，其中PPARγ、LPL基因mRNA表達量均與肌肉水分呈負相關（r=-0.940，r=-0.908，P＜0.05）；在皮下脂肪組織中LPL基因mRNA 表達量與皮厚間呈負相關（r=-0.909，P＜0.05）。

2.8 蛋白互作關系 由圖3 可知，LPL 蛋白與ATGL（PNPLA2）蛋白間存在蛋白互作，而ATGL 蛋白、PPARγ蛋白和ACC 蛋白兩兩間均存在著蛋白互作關系。同時，LPL基因和PPARγ基因參與了PPAR 信號通路（PPAR Signaling Pathway），PPARγ與ACC基因參與了AMPK 信號通路（Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase Signaling Pathway）。

圖3 PPARγ、LPL、ACC、ATGL 蛋白間互作關系

3 討 論

雜交改良是豬育種重要的實驗方法之一，利用不同親本組合雜交得到的后代可產生雜種優勢，以此獲得優良的生產性狀[11]。相同屠宰體重階段，柯樂豬× 野豬F1代背膘厚低于純種柯樂豬（42.4 mm），眼肌面積高于純種柯樂豬（23.97 cm2），表明地方豬與野豬雜交可有效地降低地方豬皮下脂肪的沉積速率，提高豬瘦肉產量[10]。

研究表明，PPARγ、LPL基因在豬中的mRNA 表達量與肌內脂肪含量呈不同程度的正相關[12-13]，ACC基因和ATGL基因均已在豬中發現，且在脂肪沉積過程中均發揮著不同的作用[14-15]。通過預測各蛋白互作關系，發現LPL 蛋白與ATGL（PNPLA2）蛋白間存在蛋白互作，且ATGL 蛋白、PPARγ蛋白和ACC 蛋白兩兩間均存在著蛋白互作關系。同時，LPL基因和PPARγ基因參與了PPAR 信號通路，PPARγ與ACC基因參與了AMPK信號通路。PPAR 信號通路主要通過PPARs 與配體結合，激活與視黃醇類X 受體（RXR）的異二聚化，然后與靶基因中的特定DNA 反應元件（PPAREs）結合，轉換來自代謝環境的適當信號來控制基因表達，具有調節脂質代謝、代謝穩態和脂肪形成等作用[16]；MAPK 信號通路主要包含經典MAPK 信號通路、JNK/p38MAPK信號通路和ERK5 信號通路，其參與了多種細胞及生長因子活化后的信號轉導，具有調節細胞增殖、生長和分化的作用[17]。本研究中，PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因在背最長肌和皮下脂肪組織中均有不同程度表達，背最長肌中相對表達量最高的為ACC基因，顯著高于ATGL基因，其次為LPL基因；在皮下脂肪中相對表達量最高的為PPARγ基因，其次為ACC基因，LPL基因表達最低。在背最長肌中LPL與PPARγ、ACC基因表達量呈顯著正相關，皮下脂肪組織中PPARγ與ACC基因間呈顯著正相關。

表6 背最長肌和皮下脂肪組織中各基因mRNA 表達量和胴體肉質性狀之間的相關性

本研究中肌內脂肪與肌肉水分呈顯著負相關（r=-0.911），這與在從江香豬中的研究結果相同[13]，同時本研究還發現肌肉水分和LPL及PPARγ基因表達量呈顯著負相關。肌肉水分直接影響肉色和嫩度等肉質性狀，也關系到肉產品的存儲時長[18]。前人研究發現，LPL基因在大圍山微型雞腿肌中的表達顯著高于胸肌，而腿肌和胸肌中的肌肉水分含量卻剛好相反[19]；在昭烏達羊背最長肌中，PPARγ基因的表達量低于烏拉特羊，但昭烏達羔羊肉的肌肉水分含量高于烏拉特羊[20]。這與本研究中LPL和PPARγ基因表達量與肌內水分間呈顯著負相關的結果相同。對16 周齡九龍鵝中ATGL基因mRNA的表達與機體脂肪沉積之間的相關性進行研究發現，ATGL基因mRNA 的表達量與皮下脂肪率呈顯著正相關，而與腹部脂肪率、胸肌率、腿肌率、腿肌肌內脂肪率和胸肌肌內脂肪率呈不同程度負相關，表明ATGL基因對九龍鵝在機體脂肪沉積過程中具有一定的調控作用[21]。姚焰礎[22]研究發現蘇尼特羔羊肌內脂肪含量與ACC基因和LPL基因的mRNA 表達量呈極顯著或顯著正相關，這與本實驗在背最長肌中豬脂肪沉積相關酶基因的表達均與肌內脂肪間呈正相關的結果類似。

此外，本研究發現，LPL基因與皮厚呈負相關。LPL的基因表達是脂肪細胞分化的早期標志之一，限制著血漿甘油三酯的清除率和脂肪酸的組織攝取率[23]。在牛前體脂肪細胞中，過表達或沉默miR-224 時，C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、FASN和PLIN1相對表達量隨之降低或上升，而miR-224 靶向LPL基因并存在負調控關系，表明LPL基因對牛前體脂肪細胞的成脂分化具有調控作用[24]。同時在貴州從江香豬LPL基因的內含子4 中存在AFa I 酶切變異位點與皮厚性狀指標顯著相關[25]，這與本研究中LPL基因與皮厚呈負相關類似，暗示了LPL基因可作為豬脂肪沉積相關重要候選基因。計劃下一步將采用細胞培養和細胞轉染等技術對脂肪沉積相關酶基因從細胞水平進行研究，進一步了解其在豬脂肪沉積過程中的調控作用。

4 結 論

本研究發現背最長肌組織中PPARγ、LPL基因表達量均與肌肉水分呈顯著負相關；在皮下脂肪組織中LPL基因表達量與皮厚間呈顯著負相關。本研究結果可進一步印證LPL基因在柯樂豬×野豬F1代脂肪沉積過程中發揮著重要作用。