熱應激下齊興肉兔睪丸組織的轉錄組分析

鄭 潔，謝曉紅*，雷 岷，鄺良德，張翔宇，李叢艷，楊 超，唐 麗，張翠霞，郭志強

（1.四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

隨著全球氣候日益變暖，近年來許多地區出現夏季持續高溫天氣。夏季高溫引起的動物熱應激導致其新陳代謝受損，生產性能降低，在極端條件下甚至死亡，成為困擾畜牧生產的一大難題。四川省作為全國肉兔生產第一大省，夏季氣溫更是突破了40℃。研究表明，熱應激對肉兔的影響包括呼吸速率加快、免疫系統受損、抗氧化系統下降和繁殖性能降低等[1]。與其他動物相比，公兔由于其低效的體溫調節機制[2]，導致對環境溫度更為敏感。當環境溫度達到28℃以上，會引起公兔性欲下降、精液量減少、精子活力降低及精子畸形率升高，甚至暫時性不育，間接導致母兔受胎率降低[3]，降低肉兔生產能力，給養兔業帶來較大的經濟損失。

目前，轉錄組測序技術已用于研究湖羊[4]、雞[5]、鴨[6]等動物與熱應激相關的差異表達基因。但公兔熱應激相關候選基因和途徑的研究很少。睪丸在雄性生殖系統中起著核心作用，作為精子發生部位，其精子發生過程涉及許多雄性生殖細胞特異性基因產物。此外，睪丸也是雄性動物對不同溫度反應最敏感的器官。齊興肉兔是四川省自主培育的第一個肉兔專門化品系，其較好的耐濕熱性是優良特性之一[7]。本研究以齊興肉兔的睪丸為測序材料，構建急性熱應激處理下的公兔睪丸轉錄組文庫，篩選差異表達基因，挖掘公兔耐熱相關的候選基因，探究公兔在高溫環境中相關基因的表達及響應熱應激的分子機制，為耐熱性家兔的育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗前期對周邊環境、實驗室、兔舍和飼養設備等進行徹底消毒。選擇100 只齊興肉兔成年公兔建立實驗群體，所有公兔單籠飼養，在相同條件和營養水平下由專人飼喂，自由采食、自由飲水51 d 后（一個精子生成周期），選擇20 只公兔作為熱應激組，置于人工氣候實驗室，通過10:00—14:00 提高環境溫度至（37±1）℃，溫濕指數（THI）＞30，模擬四川夏季高溫高濕氣候，建立為期14 d 的熱應激公兔睪丸精子發生模型。另外20 只作為對照組飼養在（24±1）℃，THI ＜27.8 的環控兔舍。14 d 后每組隨機選取4 只公兔（轉錄組測序）和12 只公兔（實時定量PCR 驗證）進行屠宰，迅速采集睪丸組織放入液氮中保存備用。

1.2 環境THI 測定 在人工氣候實驗室及環控兔舍中部距地面15 cm 處掛置Apresys 179-TH 溫濕度記錄儀，設10 min 為間隔記錄試驗期間溫度和濕度，利用Marai等[8]提出的THI 公式測定環境THI 指數：THI=db-[（0.31-0.31RH）（db-14.4）]，db 為溫度（℃），RH為相對濕度。

1.3 齊興肉兔睪丸RNA 提取 利用Trizol 法提取樣品總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 濃度和純度，結合瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA 質量，所提取的總RNA置于超低溫冰箱（-80℃）保存備用。

1.4 齊興肉兔睪丸轉錄組測序的cDNA 文庫構建 對檢測合格的RNA 使用試劑盒去除rRNA，并將mRNA隨機打斷，在M-MuLV 逆轉錄酶體系中合成cDNA 第1 條鏈，加入dNTPs（除了dTTP）、RNase H、DNA polymerase I 和緩沖液合成cDNA 第2 條鏈，純化后的雙鏈cDNA 經過末端修復、加A 尾并連接測序接頭。采用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，通過PCR 構建鏈特異性文庫，利用llumina HiseqTM測序平臺完成高通量測序。

1.5 測序數據的處理與分析 對獲得的原始數據（Raw reads）使用Trimmomatic 消除接頭和低質量reads，得到有效數據（Clean reads）用于后續的數據分析。根據差異基因的表達量利用DESeq 進行基因表達差異分析，并進行差異顯著性檢驗，以qValue＜0.05 且差異倍數|FoldChange|＞1.4 為闕值，篩選熱應激組和對照組公兔睪丸組織的全部差異基因。通過GO 功能分析確定差異表達基因使用的主要生物學功能，并對差異表達基因進行KEGG 富集分析，篩選出與本研究相關的信號通路。

1.6 差異基因的實時定量PCR 驗證 參照GenBank 中公布的家兔HSPB1、CDK6和RAB37基因序列，利用Primer Primier5.0 軟件設計特異性引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成（表1）。采用2-ΔΔCt法對基因相對表達量進行統計分析。

表1 RT-PCR 引物信息

2 結果與分析

2.1 環境THI 國際上按THI 將家兔熱應激分為4 個等級：THI＜27.8 為無熱應激，27.8≤THI＜28.9 為中等熱應激，28.9≤THI＜30 為重度熱應激，THI＞30 為極重度熱應激。如圖1 所示，試驗期間人工氣候實驗室每日平均THI 指數均在27.8 以上，其中00:40—09:50 處于中度熱應激，10:00—16:40 處于極重度熱應激，16:50 至次日00:30 處于重度熱應激；環控兔舍每日平均THI 均在27.8 以下，該條件下肉兔沒有處于熱應激狀態。

圖1 實驗期間THI 指數

2.2 轉錄組測序數據質控 對獲得的原始數據進行統計，平均每個樣品產出65 501 572 bp 原始數據（Raw reads）。使用Trimmomatic 消除接頭和低質量reads，平均每個樣本得到63 968 046 bp 的有效數據（Clean reads），有效數據所占比例為97.66%，質量超過Q30的堿基占過濾后序列的96.00%，GC 含量在56.06%。說明熱應激組和對照組轉錄組測序質量好，獲得有效數據數量多，測序質量好，符合進一步生物信息學分析要求，見表2。

表2 過濾后的數據質量統計

2.3 差異表達基因統計 利用RNA-seq 技術檢測肉兔睪丸熱應激組和對照組間差異表達基因，使用DESeq 進行基因表達差異分析，結果發現，以qValue＜0.05 且差異倍數|FoldChange|＞1.4 為闕值，熱應激組與對照組相比765 個基因顯著上調，37 個下調（圖2）。

圖2 肉兔睪丸差異表達基因volcano-plot 分布圖

2.4 差異表達基因聚類分析 對篩選出的差異表達基因做聚類分析（圖3），結果顯示熱應激組與對照組各樣本中高低表達水平的基因分別聚類在一起。

圖3 差異表達基因聚類分析

2.5 差異表達基因GO 分析 對肉兔熱應激組和對照組上調差異表達基因使用topGO 進行GO 富集分析，結果見表3。按照GO 功能分類方式分為3 大類，包括生物過程、細胞組分和分子功能。上調差異基因富集到生物過程621 個基因，細胞組分682 個基因，分子功能560 個基因，就生物過程而言，其中生物過程類中細胞過程（Cellular Process）所占比例最高，有538 個，其次是生物調節（Biological Regulation）（圖4）；在細胞組分類中細胞（Cell）所占比例最高，有600 個，其次是細胞部分（Cell Part）；在分子功能類中結合（Binding）所占比例最高，有531 個，其次是離子結合（Ion Binding）。

下調差異基因富集到生物過程26 個基因，細胞組分29 個基因，分子功能23 個基因，其中在生物過程類中同樣是細胞過程（Cellular Process）所占比例最高，有20 個，其次也是細胞過程的調節（Regulation of Cellular Process）、調節生物過程（Regulation of Biological Process）和生物調節（Biological Regulation）；細胞組分類中細胞（Cell）和細胞部分（Cell Part）所占比例最高，各有26 個，其次是細胞內（Intracellular）；在分子功能類中同樣是結合（Binding）所占比例最高，有17 個，其次也是離子結合（Ion Binding）（圖5）。

表3 注釋到該GO 下的差異表達基因數目

2.6 差異表達基因KEGG 分析 使用clusterProfiler 對差異顯著基因進行KEGG 通路富集分析，得到511 條通路，其中主要富集于細胞因子與細胞因子受體的相互作用、胞吞作用、PI3K-Akt 信號通路、核糖體、細胞黏附分子（CAMs）、MAPK 信號通路等通路（圖6）。

2.7 熱應激下精子發生差異表達基因的RT-PCR 初步驗證 通過對表達基因篩選、功能注釋和富集分析后，篩選出HSPB1、CDK6和RAB37等3 個與參與應激反應、精子生成有關的基因進行熒光定量PCR 檢驗（圖7）。其中HSPB1為上調差異表達基因，CDK6、RAB37為下調差異表達基因，且定量結果與RNA-seq 結果趨勢一致。證明轉錄組在篩選差異表達基因方面的可靠性。

3 討 論

圖4 上調差異表達基因GO 富集分析

圖5 下調差異表達基因GO 富集分析

哺乳動物為獲得最佳的精子發生，通常睪丸溫度需要比體溫低2～5℃[9]。適宜的溫度是精子發生的必要條件。當外界環境溫度過高時，機體產生的熱量超過散發的熱量就會產生熱應激。Nizza 等[10]研究發現，熱應激導致公兔性欲降低（射精時間從23.6 s 延長至25.3 s），并對精子發生產生負面影響。Maria 等[11]研究表明，熱應激條件下，精子活力、精子曲線速度、精子平均速度以及代謝活性顯著低于常溫組。郭振慧等[12]研究發現，熱應激導致公兔睪丸組織萎縮，曲細精管生精上皮細胞明顯減少，中央管腔增大，初級精母細胞排列疏松，空間增大，精子數量明顯減少。唐良美[13]報道，齊興兔精子活力在6—10 月仍保持在0.8 以上，而外血親本兔的精子活力則隨氣溫升高而下降，且精子密度一直低于齊興兔。

隨著動物抗性育種的發展，耐熱性被認為是能遺傳的。篩選與鑒定耐熱性相關的候選基因將有助于選育抵御熱應激的優良品種[14]。本研究對齊興肉兔睪丸組織熱應激組和對照組的cDNA 文庫進行分析，共檢測到已注釋765 個基因表達上調，37 個基因表達下調。對差異表達基因進行篩選、功能注釋和富集分析后發現，參與熱應激反應和精子生成的基因熱休克蛋白B1（HeatshockproteinB1，HSPB1）在熱應激組表達量顯著高于對照組，細胞周期蛋白依賴型激酶6（Cyclin-Dependent Kinase 6，CDK6）和RAB37 在熱應激組表達量顯著低于對照組。

圖6 差異表達基因KEGG 富集分析

圖7 差異表達基因RT-PCR 驗證分析

HSPB1 又稱HSP25/HSP27，是第1 個在哺乳動物中被證實的小分子熱休克蛋白[15]。HSPB1 活化后與肌節的結構蛋白和細胞骨架結合，可增加對熱應激的耐受性[16]。熱休克蛋白是否能被正常激活取決于其對熱應激的耐受性是否形成。在雄性生殖系統中，HSPB1 廣泛存在于支持細胞、精原細胞、精母細胞和精子細胞[17-18]，參與生精細胞發育過程的增殖、分化及凋亡等調控作用[19-20]。睪丸受到熱應激壓力時，使HSPB1 過表達從而使精子細胞凋亡受到抑制，起到保護作用[21]。當HSPB1 受到抑制，則會導致細胞抗氧化性降低[22]。本研究發現，齊興肉兔熱應激組睪丸組織中HSPB1 高于對照組，說明其在熱應激環境中激活了抗熱應激的防御體系。

以往研究發現，CDK6 表達量降低會影響精子發生過程，誘導細胞周期停滯在G1 期，導致精子數量減少、精子活力降低和精子畸形率增加[23-24]。本研究中齊興肉兔睪丸組織熱應激組中CDK6 顯著降低，這說明熱應激過程中CDK6 受到抑制，可能阻止了G 期到S 期轉換，引起細胞周期阻滯，誘導生精細胞凋亡。

哺乳動物精子在精卵結合前必須要經過獲能和頂體反應過程。頂體反應的發生標志著精子獲能過程的完成。RAB37 屬于分泌蛋白，位于各種分泌細胞的囊泡和分泌顆粒中，對胞吞過程有直接的調控作用[25]。Peddinti 等[26]研究發現，RAB37 蛋白存在于精子蛋白質組，參與牛的精子頂體反應。本研究中齊興肉兔睪丸組織熱應激組中RAB37 顯著低于對照組，推測RAB37 在齊興肉兔精子頂體反應中起重要作用。

此外，核糖體、細胞黏附分子（CAMs）等通路檢測到一些差異表達基因，其在睪丸生理生殖活動中的作用還需進一步研究。

4 結 論

本研究對齊興肉兔睪丸組織熱應激組和對照組進行轉錄組分析，檢測基因表達的差異及相關的信號通路，篩選出HSPB1、CDK6 和RAB37 與熱應激反應、精子生成有關的基因，為豐富齊興肉兔睪丸組織轉錄組信息提供數據，為改善肉兔耐熱性及耐熱性家兔的育種提供理論基礎。