生長抑素通過抑制內質網應激反應減輕肝纖維化小鼠肝損傷研究*

都慶國，陸建文，王建華，龍延濱，薛 飛

肝纖維化(liver fibrosis，LF)是病毒、藥物、炎癥、脂肪沉積等病因刺激下發生的可逆性的肝臟損傷修復反應，其本質是肝臟損傷后細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的沉積過程，導致有功能的肝臟實質被瘢痕組織所替代，并且刺激肌纖維母細胞增殖活化，進一步產生大量的膠原蛋白和未折疊蛋白質[1-3]。內質網(endoplasmic reticulum，ER)作為真核細胞重要的細胞器，主要參與蛋白質的合成、加工、修飾、折疊、運輸等一系列生物學過程。當大量的膠原蛋白產生時，內質網啟動應激機制，即內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反應，以促進細胞存活。但若應激持續存在，細胞將啟動凋亡程序，并加速肝纖維化的發生。因此，通過抑制ERS反應減輕肝臟損傷，控制細胞凋亡是延緩肝纖維化進展的重要途徑。有研究發現，生長抑素(somatostatin，SST)可以通過減輕肝臟炎癥降低肝酶、減輕肝損傷，但是關于SST是否能夠通過減輕肝臟損傷抑制ERS反應，并進一步減緩LF形成，未見相關研究報道。本實驗以四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導小鼠LF動物模型，觀察了SST對ERS和凋亡相關蛋白表達的影響，以探討SST是否能通過抑制ERS反應減輕肝臟損傷，控制LF進展。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 40只10周齡健康野生型C57BL/6小鼠，雌雄不限，體質量(25±3)g，購于上海必凱實驗動物有限公司。CCl4、oil、二甲苯、75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、天狼星紅染色液、PBS均購于國藥集團化學試劑有限公司；注射用SST由瑞士默克雪蘭諾公司生產；抗I型膠原(collagen I)購于Southern Biotech；抗Bcl-2、抗Bax、抗CHOP購于Santa Cruz；抗BiP、抗Caspase-9(Casp-9)、抗HSC70抗體購于Abcam；二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。蛋白裂解液(RIPA)、蛋白酶抑制劑(PI)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、ECL-化學發光試劑盒、蛋白上樣緩沖液、BSA、DAB顯色液購自上海碧云天公司。

1.2 LF動物模型的建立 將40只小鼠隨機分為對照組(oil)、模型組(CCl4)、小劑量SST干預組(CCl4+SST-L)和大劑量SST干預組(CCl4+SST-H)，每組10只。除對照組外，給予其余各組小鼠25% CCl4橄欖油混合液10μl.g-1腹腔注射，2次/w；在干預組，分別給予SST 10 μg.kg-1和20 μg.kg-1皮下注射，2次/d；在對照組和模型組，給予等量生理鹽水皮下注射。造模觀察8 w后，處死動物，取血1 mL，離心取上清、凍存。取小鼠肝臟，經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，將余肝組織液氮凍存。石蠟切片行天狼猩紅染色和免疫組化染色。在10倍和20倍鏡下，隨機選擇每張切片5個視野。根據Ishak評分分析肝組織纖維化和膠原蛋白含量。按炎性改變程度，給予對應的評分：碎屑樣壞死(0～4分)；融合性壞死(0～6分)；點狀壞死(0～4分)；匯管區炎癥(0～4分)。根據肝纖維組織沉積程度，給予對應的評分(0～6分)。

1.3 血清肝功能檢測 測定血清AST和ALT水平。

1.4 肝組織蛋白表達檢測 取約20 mg凍存肝組織，充分碾磨裂解，4℃下14000 r/m離心20 min，收集上清液。用BCA試劑盒測定蛋白濃度。按Western blot操作流程進行檢測，應用Image-J軟件分析Bcl-2、Bax、Casp-9、BiP、CHOP和HSC70各條帶灰度值。以HSC70作為內參，對各目的蛋白相對表達量進行分析。

2 結果

2.1 各組肝組織病理學表現 對照組肝細胞條索結構正常，少見炎性細胞，極少膠原纖維分布于匯管區周圍，未見纖維沉積；模型組可見肝細胞排列紊亂，炎性細胞大量浸潤，粗大纖維條索明顯沉積，膠原纖維大量產生，形成纖維間隔圍繞在匯管區和血管周圍，假小葉形成；SST干預組多數肝細胞排列結構較為清晰，炎性細胞浸潤較輕，但仍可見膠原纖維沉積，穿梭于匯管區和血管周圍，程度較輕(圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學表現 (A：天狼猩紅染色，100×；B：免疫組化染色，200×，黑色箭頭所示為I型膠原纖維)

2.2 各組肝組織Ishak評分比較 與對照組比，模型組肝組織纖維化和炎性活動明顯增高，膠原蛋白沉積顯著(P<0.01)；SST干預組肝組織纖維化和炎性活動程度下降，顯著低于模型組(P<0.05)，而兩SST處理組間無顯著差異(表1、表2)。

表1 各組小鼠肝組織炎癥活動度Ishak評分比較

表2 各組小鼠肝纖維化沉積程度Ishak評分比較

2.3 各組血清肝酶水平比較 模型組血清AST和ALT水平顯著高于對照組(P<0.01)；SST干預組血清AST和ALT水平顯著低于模型組(P<0.05，表3)。

表3 各組小鼠血生化指標比較

2.4 各組肝組織凋亡相關蛋白表達比較 模型組促凋亡蛋白Bax和Casp-9相對表達量顯著強于對照組(P<0.001)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2相對表達量顯著弱于對照組(P<0.01)；SST干預組肝組織Bax和Casp-9蛋白相對表達量顯著弱于模型組(P<0.05)，而Bcl-2蛋白相對表達量未見明顯改變(圖2)。

*** P<0.001，** P<0.01，* P<0.05

2.5 各組肝組織內質網應激相關蛋白表達比較 與對照組比，模型組BiP和CHOP蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；SST干預組肝組織BiP和CHOP蛋白表達水平較模型組顯著下降(P<0.05，圖3)。

*** P<0.001

3 討論

肝纖維化是各種急慢性肝損傷導致的肝纖維化生成和炎癥反應的過程[4-8]。如不及時處理可能進展成為肝硬化甚至肝癌。在肝纖維化進程中，多種肝內細胞被活化，伴隨產生大量的炎癥因子和趨化因子，如膠原蛋白、α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白等纖維細胞相關蛋白的過表達，最終導致肝纖維化的發生。有研究表明，ECM的分泌和沉積會激發ERS。在輕度細胞炎癥反應時，ERS可通過提高蛋白質代謝能力使細胞恢復正常狀態[9-12]。當慢性持續性刺激存在時，ERS則通過促進細胞凋亡，進一步加速肝纖維化的進展。因此，通過減輕肝臟細胞炎癥反應，抑制ERS過度激活，對減緩或逆轉肝纖維化形成具有重要的意義[13-15]。

SST是一種廣泛存在于胃腸道、腦、內外分泌腺等組織的環狀多肽類激素[16-18]。研究證實，SST能夠抑制免疫過度激活，減輕炎癥反應，具有細胞保護作用。但其是否參與調節ERS，并進一步調控肝纖維化形成目前未見報道。

在本研究，我們首先建立了小鼠LF動物模型，病理學檢查見CCl4可誘導膠原和纖維沉積，肝細胞排列結構紊亂，炎癥細胞浸潤明顯。血清AST和ALT明顯升高。肝組織Ishak評分顯示肝臟炎癥活動度和纖維化表現明顯，說明CCl4成功誘導了LF的形成，并伴有嚴重肝臟炎癥性改變。給予SST干預后，肝組織病理學改變明顯減輕，肝功能和纖維化程度明顯減輕，說明SST對肝臟炎癥反應及其導致的肝纖維化程度有改善作用。

我們進一步探究了SST是否參與調解ERS。通過對凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Casp-9表達檢測，發現CCl4能夠導致促凋亡蛋白Bax和Casp-9表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調。同時，ERS相關蛋白BiP和CHOP表達顯著增加，說明CCl4激活ERS反應并導致細胞大量凋亡。給予SST干預后，肝組織Bax和Casp-9蛋白表達顯著下降，BiP和CHOP蛋白水平明顯降低，說明SST可以抑制纖維化小鼠肝組織ERS，減輕細胞凋亡程度[19,20]。

綜上所述，本研究結果表明SST能夠通過改善肝臟炎癥狀態，抑制ERS，從而減輕肝臟損傷，抑制細胞凋亡，最終達到改善LF的目的。本研究為LF的防治提供了新的理論依據，但ERS涉及的通路較多，關于SST具體影響哪條通路還有待進一步深入研究。