間充質干細胞治療2 型糖尿病小鼠非酒精性脂肪肝的機制研究

高杰清，薛 婧，李 冰，于松巖，母義明，沙可夫

1 首都醫科大學附屬北京康復醫院 內分泌科，北京 100144；；2 解放軍總醫院第一醫學中心 內分泌科，北京 100853

近年來非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD)患病率快速增長，已經成為全球最常見的慢性肝病[1]。2018 年我國NAFLD 平均患病率為32.9%，糖尿病人群中其患病率更高，達57%~80%[2-3]。NAFLD 不僅可以導致肝硬化、肝細胞癌等肝內病變，還與肥胖、糖尿病等多種代謝性疾病密切相關，是心血管疾病的獨立危險因素[4-5]。然而，除了改善生活方式、減重、降脂外，臨床上尚無專門用于治療NAFLD 的藥物[6]。NAFLD 疾病譜較廣，從單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，到肝硬化、肝細胞癌[7]。單純性脂肪肝向NASH進展的關鍵因素是炎癥[8]。肝異常炎癥狀態不但加速NAFLD 進展，還是全身炎癥反應、動脈粥樣硬化的關鍵機制[9]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有多向分化潛能的成體干細胞，近年來MSCs 因突出的免疫調節功能被廣泛用于慢性炎癥性疾病治療的研究[10-11]。本研究將臍帶間充質干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell，UC-MSCs)作用于2 型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)NAFLD 模型，探討UC-MSCs 對脂肪肝的作用及其機制。

材料與方法

1 實驗動物 8 周齡雄性C57BL/6 小鼠24 只，18~20 g，SPF 級，由解放軍總醫院實驗動物中心提供并飼養。飼養條件：環境溫度22℃~25℃，相對濕度40%~60%，光照/黑暗時間為12 h/12 h。適應性喂養1 周后開始實驗，所有操作均符合實驗動物保護法。

2 主要試劑 高脂飼料(D12492，美國)；鏈脲佐菌素(Sigma，美 國)；Trizol RNA 提取試劑(Invitrogen，美國)；PrimeScript? RT reagent Kit(Thermo， 美 國)； SYBR? Premix Ex TaqTM(TOYOBO，日本)；PCR 引物(Invitrogen，美國)。

3 造模與分組 18 只C57BL/6 小鼠高脂喂養12周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素100 mg/kg，3 d后開始監測血糖，連續3 d 隨機血糖≥16.7 mmol/L認為T2DM 模型建造成功。這些糖尿病小鼠繼續高脂喂養，4 周后隨機處死6 只，提取肝組織行HE 染色，光鏡下觀察、拍照，對肝組織病理學特征(肝細胞損傷、脂肪變性、炎癥)進行評分，評分>5 分視為NAFLD 模型制備成功[12]。將造模成功小鼠12 只隨機分為脂肪肝組(NAFLD 組，n=6)和UC-MSCs 治療組(UC-MSCs 組，n=6)，另取同期正常小鼠作為對照組(n=6)。

4 UC-MSCs 實驗 UC-MSCs 來源于剖宮產的足月胎兒臍帶，該臍帶由解放軍總醫院婦產科提供，均簽署知情同意書。參照前期文獻[13-14]，分離去除臍帶外膜組織、血管組織及血管內殘留血液，獲得臍帶Wharton 膠組織，將其剪碎，0.1%Ⅳ型膠原酶消化、過濾，收集濾液并接種、傳代培養，至第4 代時備用。實驗開始時，將備用的UC-MSCs 重懸于PBS 中，調整細胞數為1×107/mL。UC-MSCs 組小鼠每只經尾靜脈注射1×106UC-MSCs(0.2 mL)，每周1 次，連續4 周；NAFLD 組及對照組小鼠輸注等體積PBS。

5 觀察指標 1)糖 代謝：連續監測各組小鼠血糖、體質量，并于治療結束后第7 天進行腹腔糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)和胰島素敏感度實驗(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)。2)肝功能及脂代謝：Elisa檢測血清谷草轉氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase，AST)、谷丙轉氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽 固 醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。3)肝病理分析：肝組織制作成石蠟切片，室溫下用蘇木精-伊紅進行染色，光學顯微鏡下觀察并采集圖像，按照美國國立衛生研究院NASH 臨床研究網病理工作組制定的 NAFLD 活動度積分(NAFLD activity score，NAS)評估指南進行評定[12]。4)肝巨噬細胞表型檢測：qRT-PCR 檢測肝M1/M2 型巨噬細胞表面標志物iNOS(M1 型)、CD11c(M1 型)、CD206(M2 型)、Arg-1(M2 型)的表達情況，并檢測相關炎癥因子的表達。

6 統計學處理 采用SPSS20.0 軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 UC-MSCs 對NAFLD 小鼠糖代謝的影響 與對照組比較，NAFLD 組小鼠血糖、體質量明顯升高(P均＜0.05)；與NAFLD 組比較，UC-MSCs 輸注后第3 天小鼠的血糖明顯下降，且呈逐漸下降的趨勢(圖1A)；體質量也有下降趨勢，但無統計學差異(圖1B)。IPGTT 結果顯示，與對照組比較，NAFLD 組血糖升高明顯，UC-MSCs 組在30 min、60 min、90 min、120 min 時血糖上升幅度均顯著低于NAFLD 組(P均＜0.05，圖1C)，提示小鼠的糖代謝得以改善。IPITT 結果顯示，輸注胰島素后，UC-MSCs 組小鼠血糖下降幅度明顯大于NAFLD 組(P均＜0.05，圖1D)，更接近于對照組，提示小鼠胰島素抵抗也得到明顯減輕。

圖 1 UC-MSCs 對NAFLD 小鼠糖代謝的影響 (aP<0.05, vs 對照組; bP<0.05, vs NAFLD 組)A：隨機血糖；B：體質量；C：IPGTT；D：IPITTFig.1 Effect of UC-MSCs infusion on glucose metabolism in NAFLD mice (aP<0.05, vs control group; bP<0.05, vs NAFLD group)A: random blood glucose; B: body mass; C: IPGTT; D: IPITT

2 UC-MSCs 對NAFLD 小鼠肝功能及脂代謝的影響 NAFLD 組小鼠AST、ALT、TG、TC 及LDL-C 明顯高于對照組(P均＜0.05)；UC-MSCs輸注后，AST 較NAFLD 組降低了34.02%(P＜0.001，圖2A)，ALT 降低了20.38%(P=0.007，圖2B)；TG、TC 及LDL-C 也明顯低于NAFLD 組(P均＜0.05，圖2C、圖2D、圖2E)，但仍高于對照組，提示治療組小鼠肝功能及脂代謝均得到一定程度改善。

3 UC-MSCs 對NAFLD 小鼠肝脂肪變及炎癥的影響 肝組織行HE 染色，光鏡下觀察，正常喂養組小鼠肝細胞形態正常，肝小葉結構整齊，偶可見肝細胞脂肪變性；NAFLD 組肝細胞呈彌漫性脂肪變，肝小葉結構紊亂，細胞核變形甚至消失，并可見炎細胞灶；UC-MSCs 輸注組肝細胞脂肪變程度大大減輕，炎癥反應也減輕(圖3A，圖3B)。根據HE 結果計算NAS 積分，UC-MSCs 組評分為2.66±0.53，顯著低于NAFLD 組的5.67±0.58(P=0.001，圖3B)，進一步證實小鼠NAFLD 明顯減輕。檢測炎癥因子的表達水平，與對照組比較，NAFLD 組小鼠促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6的表達明顯升高，抑炎因子IL-4、IL-10 的表達降低；UC-MSCs 治療后上述升高的促炎因子表達明顯下調，上述降低的抑炎因子表達明顯上調(P均＜0.05，圖3C)，提示肝組織慢性炎癥減輕。

圖 2 UC-MSCs 對NAFLD 小鼠肝功能及脂代謝的影響(aP<0.05, vs 對照組; bP<0.05, vs NAFLD 組)A：谷草轉氨酶；B：谷丙轉氨酶；C：三酰甘油；D：總膽固醇；E：低密度脂蛋白膽固醇Fig.2 Effect of UC-MSCs infusion on liver function and lipid metabolism in NAFLD mice (aP<0.05, vs control group; bP<0.05, vs NAFLD group)A: glutamic-oxaloacetic transaminase; B: glutamic-pyruvic transaminase; C: triglyceride; D: total cholesterol; E: low-density lipoprotein cholesterol

圖 3 UC-MSCs 對NAFLD 小鼠肝病理及炎癥的影響 (aP<0.05, vs 對照組; bP<0.05, vs NAFLD 組)A：肝組織HE 染色；B：NAS 評分；C：qRT-PCR 檢測肝組織炎癥因子的基因表達Fig.3 Effect of UC-MSCs infusion on hepatic steatosis and liver inflammation in NAFLD mice (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs NAFLD group)A: representative images of HE-stained liver sections of the indicated groups (scale bar=250 μm); B: NAFLD activity score; C: the expression of inflammation-related gene expression in liver by qRT-PCR analysis

4 UC-MSCs 對肝巨噬細胞表型的影響 qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，NAFLD 組肝組織促炎型M1 型巨噬細胞的表面標志物iNOS、CD11c 的表達明顯升高(P均＜0.05)，抑炎型M2 型巨噬細胞表面標志物CD206 的表達明顯降低(P＜0.05)。與NAFLD 組比較，UC-MSCs 組iNOS、CD11c 表達分別下降了33.89%、32.43% (P均＜0.05，圖4A，圖4B)；Arg-1、C206 的表達分別上調了52.26%、160.14%(P均＜0.05，圖4C，圖4D)，且高于對照組，提示UC-MSCs 促進肝巨噬細胞向M2 型極化。

圖 4 UC-MSCs 對肝巨噬細胞表型的影響，巨噬細胞表型相關蛋白的表達：(M1 型) iNOS (A)，(M1 型) CD11c (B)，(M2 型) Arg-1 (C)，(M2 型)CD206 (D) (aP<0.05, vs 對照組; bP<0.05, vs NAFLD 組)Fig.4 Effect of UC-MSCs infusion on macrophage phenotype in liver. The expression of macrophage phenotype-related gene expression in liver tissue: M1 macrophage maker, iNOS (A) and CD11c (B); M2 macrophage maker, Arg-1 (C) and CD206 (D) (aP <0.05, vs control group; bP <0.05, vs NAFLD group)

討 論

NAFLD 患病率高、危害大，至今尚無批準專門用于臨床治療NAFLD 的藥物。究其原因，主要是NAFLD 發病機制復雜，近年研究發現“多重打擊”學說可較全面地揭示NAFLD 的發病機制。這一學說認為NAFLD 的發病涉及到肝、腸道、脂肪等組織，是多種因素共同引起的肝慢性炎癥[15]。肝組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β 增多，可以上調脂質合成的關鍵酶——固醇調節元件結合蛋白-1C和二酰基甘油酰基轉移酶，使肝細胞脂肪合成增多、氧化減少，引起肝脂肪變性和肝細胞損傷[8]。損傷的肝細胞進一步激活免疫細胞，使炎癥反應級聯放大，形成惡性循環。大量研究證實肝慢性炎癥不僅可促進NAFLD 進展，引起肝內、外并發癥[9]，還是NAFLD 作為代謝性肝病與T2DM、肥胖共同的發病機制。本研究同樣發現NAFLD 小鼠促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 表達明顯上調，肝小葉炎細胞浸潤，形成炎細胞灶；經UC-MSCs 治療后促炎因子的表達顯著下降、炎細胞灶消失，肝細胞脂肪變性明顯減輕，提示UC-MSCs 在緩解NAFLD 的同時減輕了肝慢性炎癥這一關鍵因素，為NAFLD 的治療帶來了希望。同時我們發現，經UC-MSCs 治療后肝組織促炎因子的表達雖降低，但仍高于對照組水平，與該組小鼠糖代謝、肝功能、血脂水平改善程度一致，提示減輕肝炎癥可能是UC-MSCs 緩解NAFLD 的主要機制。

肝巨噬細胞占肝非實質細胞的20%~35%，在保持肝穩態中起著核心作用。健康個體肝中浸潤的巨噬細胞多呈現“耐受性M2”表型；高脂飲食或肥胖條件下，巨噬細胞被激活，表現為促炎型M1 型，在引起及加劇NAFLD 相關炎癥中發揮著重要作用[16]。既往研究顯示，間充質干細胞可通過作用于肝巨噬細胞發揮治療作用。在膿毒癥導致的急性肝損傷研究中發現MSCs 輸注后Kupffer細胞向M1 型激活受到抑制，炎癥因子TNF-α和 IL-6 的表達下調，肝細胞損傷得到緩解[17]。在阿司匹林導致的急性肝損傷模型中發現，MSCs 的保護作用在清除巨噬細胞后明顯減弱[18]。還有文獻報道MSCs 對肝纖維化的減輕作用與促進Kupffer細胞向M2 型極化密切相關[19]。為此，本研究檢測了肝巨噬細胞表型的變化，結果顯示，與正常喂養組比較，NAFLD 組肝組織中M1 型巨噬細胞表達上調，M2 型巨噬細胞表達下調，與既往研究一致[20]。UC-MSCs 治療后，促炎型M1 型巨噬細胞的表面標志物iNOS、CD11c 表達明顯下調，M2 型巨噬細胞表面標志物CD206、Arg-1 的表達明顯上調，甚至高于正常對照組，提示在NAFLD 模型中，UC-MSCs 可促進肝組織促炎型的M1 型巨噬細胞向M2 型極化，減輕肝慢性炎癥，進而改善NAFLD。

綜上所述，UC-MSCs 可有效調節巨噬細胞由促炎型(M1 型)向抑炎型(M2 型)極化，抑制肝組織炎癥反應的持續發生，改善肝功能及脂代謝，治療NAFLD。這些特點在一定程度上為UC-MSCs臨床合理化應用提供了實驗基礎。但UC-MSCs 如何調節巨噬細胞極化，具體作用機制如何，本研究并未闡明。因此，下一步的研究重點是探索UC-MSCs 發揮作用的效應分子以及信號通路，為NAFLD 的治療提供新靶點。