外施肌醇對黃瓜幼苗低溫抗性的影響

苗田田 李 強 余宏軍 劉 鵬 郝 佳 蔣衛杰

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜（Cucumis sativusL.）起源于亞熱帶地區，喜溫不耐寒，對低溫敏感性較高（安志信 等，2006）。我國是世界上黃瓜栽培面積最大的國家，作為設施栽培最重要的蔬菜作物之一，隨著設施栽培的普及推廣，黃瓜在我國北方地區的反季節栽培中易受到低溫影響，引起產量和品質的大幅度下降（李彩霞 等，2019）。在我國冬季和早春栽培中黃瓜受到低溫傷害，幼苗生長緩慢或者停止生長，葉片黃化萎縮，嚴重時能夠造成植株死亡（李淑菊等，2020）。因此，提高黃瓜的低溫抗性在生產中有重要作用。

肌醇（inositol），又稱環己六醇，分子式為C6H12O6，相對分子質量為180.16，有9 種異構體，較重要且普遍存在的是肌肉肌醇（myo-inositol，MI）（楊楠 等，2017），本試驗中使用的肌醇即肌肉肌醇。肌醇在植物生長和發育過程中參與信號傳導、營養儲存、細胞壁生成、滲透調節（Majumder et al.，1997；Loewus &Murthy，2000；Pendaries et al.，2005；Sengupta et al.，2012）等生命活動。肌醇也是抗壞血酸（ascorbate，ascorbic acid，AsA）的底物之一（圖1），AsA 作為植物重要的抗氧化劑，在植物受到低溫、強光、鹽脅迫和干旱等脅迫時含量增加，它是植物體內活性氧（ROS）清除劑（Rao et al.，1995；Mittler，2002；Yurena et al.，2014）。肌醇合成AsA 過程中的關鍵酶是肌醇加氧酶（MIOX），研究發現，與野生型擬南芥相比，過表達MIOX轉基因擬南芥植株AsA 含量增加了2～3 倍（Lorence et al.，2004），過表達MIOX轉基因植株葉片肌醇含量顯著低于野生型擬南芥肌醇含量（Endres &Tenhaken，2009）；在轉基因SlMIOX番茄上外施肌醇能夠提高AsA 含量，同時提高番茄的逆境抗性（Munir et al.，2020）。

肌醇作為細胞中重要的一類糖類物質，近年來開始受到人們關注。脅迫條件下外施肌醇的水稻、玉米和小麥幼苗抗氧化酶活性顯著提高，丙二醛（MDA）和過氧化氫含量顯著降低（郭元飛 等，2014；姚慧和夏凱，2014；袁紅梅 等，2014）。大麥發芽過程中添加肌醇、α-淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶和庫爾巴哈值都顯著提高（張善飛 等，2012）。但是目前外施肌醇在蔬菜上的應用以及對肌醇代謝相關基因水平變化的研究還鮮見報道。本試驗以黃瓜材料9930 為研究對象，苗期低溫條件下噴施肌醇，觀測在冷脅迫下黃瓜外觀、干鮮質量變化，以及植株抗冷性相關生理指標；并采用RT-PCR 技術，分析肌醇代謝相關基因在低溫脅迫下的響應和水平變化，為外施肌醇對黃瓜抗冷性的影響提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017 年10—12 月在中國農業科學院蔬菜花卉研究所無土栽培課題組人工氣候室內進行，選用材料為黃瓜（Cucumis sativus）遺傳背景清晰的測序品種 9930（由本所顧興芳老師贈與，本課題組自行繁種）。選取飽滿的黃瓜種子進行催芽，用50 ℃溫水浸泡30 min，5%次氯酸鈉溶液遮光浸泡15 min，清水沖洗2～3 次，放置于28 ℃恒溫培養箱中培育24 h，種子露白后在穴盤中播種育苗。待黃瓜長至三葉一心，選用生長狀態一致的幼苗進行低溫和1 次噴施肌醇處理。肌醇濃度為0.8 g·L-1，由國藥集團生化試劑公司提供。

1.2 試驗處理與取樣時間

試驗分別在常溫和低溫人工氣候室進行，相對濕度為65%，光照強度為150 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h/12 h（晝/夜）。設置3 個處理：常溫對照（CK），晝夜溫度為28 ℃/18 ℃，葉面噴施0 g·L-1肌醇（即噴施蒸餾水，下同）；低溫對照（T1），保持晝夜溫度為6 ℃，葉面噴施0 g·L-1肌醇；低溫處理（T2），保持晝夜溫度為6 ℃，葉面噴施0.8 g·L-1肌醇，以葉片均勻附著一層小水珠為準。每個處理100 株，3 次重復，每個重復包含3 株黃瓜葉片。

1.3 植物生物量的測定

低溫處理72 h 后，將CK、T1 處理和T2 處理的黃瓜幼苗轉移至常溫條件下培養6 d 回暖，回暖后用萬分之一天平測定植株鮮質量，將植株鮮樣置于烘箱105 ℃殺青15 min，80 ℃恒溫72 h，然后用電子天平稱量植株干質量。

1.4 電解質外滲率的測定

電解質外滲率的測定參考張平艷等（2014）的方法，分別在低溫處理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黃瓜葉片樣品，每個處理用打孔器取0.5 g鮮樣，用蒸餾水洗凈后浸泡在20 mL 蒸餾水中，抽氣3 次，每次20 min，放置2 h，其間多次搖動，測定此時的電導率，記為EC1。將組織沸水浴10 min，使得組織完全被殺死，冷卻至室溫后測定此時的電導率，記為EC2。同時測定蒸餾水的電導率記為EC，試驗重復3 次。電解質外滲率（El）的計算公式為：El=100 ×（EC1 -EC）/（EC2 -EC）。

1.5 生理指標的測定

分別在低溫處理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黃瓜葉片樣品，AsA、總抗壞血酸（Total AsA，T-AsA）和脫氫抗壞血酸（DHA）含量參照Zhang 等（2016）的方法測定；脯氨酸、丙二醛含量的測定參考王學奎（2006）的方法；采用試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司，中國）測定H2O2、含量；采用試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司，中國）測定抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（過氧化物酶）、CAT（過氧化氫酶）活性；可溶性糖和可溶性蛋白含量分別采用蒽酮比色法和考馬斯亮藍染色法測定。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

分別在低溫處理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黃瓜葉片，葉片用錫紙包裹迅速置于液氮中，保存在超低溫冰箱中。采用Trizol 方法提取植物樣品中的總RNA（Zhang et al.，2016），用滅菌的超純水溶解RNA，并用NanoDrop（Bio-Rad，美國）測定樣品RNA 濃度和OD260/OD280值，然后根據所測濃度調節最終RNA 濃度為1 000 ng·μL-1，并用試劑盒（Fermentas，美國）對樣品RNA 進行反轉錄，反轉錄合成的cDNA 即為qRT-PCR 的模板。qRT-PCR 的體系共15 μL，其中包含：7.5 μL iQ SYBR Green Supermix，目的基因上下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，cDNA 模板0.75 μL，滅菌超純水6.15 μL。試驗中全部的qRT-PCR 均以黃瓜管家基因Actin作為內參基因，其熒光定量值作為計算內標，參照Livak 和Schmittgen（2001）的2-ΔΔCt方法計算樣品目的基因相對表達量，每個樣品均設置3 次技術性重復。

試驗中根據測序黃瓜9930 材料數據庫中的基因序列，用Primer 5.0 設計不同目的基因的特異性引物（表1），所有引物合成和測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。qRT-PCR 將在iQTM5 多重實時熒光定量PCR 儀器（Bio-Rad，美國）上進行，具體程序為：95 ℃預變性30 s；40個PCR 循環（95 ℃變性5 s，再60 ℃退火30 s）；溶解曲線分析以20 ℃·s-1快速升溫至95 ℃，迅速降低（20 ℃·s-1）至65 ℃持續15 s，再以0.1 ℃·s-1的速度升高至95 ℃，在達到退火溫度時采集熒光。

表1 特異性引物設計

1.7 數據處理

采用SPSS 16.0 軟件進行數據處理及結果分析，采用Duncan 法進行多重比較及差異顯著性分析。采用Graphpad Prism 5.0 作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下外施肌醇對黃瓜幼苗長勢、幼苗生物量和電解質外滲率的影響

由圖2 可以看出，低溫處理72 h 后，T1 處理的植株第1 片真葉葉脈變黃，第3 片真葉整體變黃失綠且萎縮，T2 處理的植株第1 片真葉葉邊緣變黃，第3 片真葉受傷害較小。

低溫脅迫回暖6 d 后，T2 處理的植株干、鮮質量均顯著高于T1 處理，但顯著低于CK，可見低溫脅迫下植株干、鮮質量降低，噴施肌醇對黃瓜幼苗冷害有緩解作用。低溫脅迫下植株的電解質外滲率明顯增加，且呈持續升高的趨勢。低溫處理后0～12 h，T1 和T2 處理的電解質外滲率升高但兩處理間無顯著差異，處理24 h 后T1 處理的電解質外滲率顯著高于T2 處理。其中低溫處理48 h 時T1 與T2 處理相差最大，T2 處理的電解質外滲率比T1 處理降低了20.44%（圖3）。

2.2 低溫脅迫下外施肌醇對黃瓜幼苗抗壞血酸含量的影響

由圖4 可知，在低溫條件下黃瓜幼苗葉片中AsA、T-AsA 和DHA 含量呈現先增加后降低的趨勢。T2 處理的AsA 含量在處理后12 h 達到最大值，此時T2 和T1 處理分別比CK 增加了131.27%和46.49%；在處理后12 h 和24 h，T2 處理的AsA 含量顯著高于T1 處理，且在處理后72 h，T2 處理的AsA 含量顯著高于T1 處理和CK。T2 處理的T-AsA含量在處理后12 h 達到最大值，是CK 的2.91 倍，T1、T2 和CK 三者之間呈現顯著差異。低溫條件下T1 和T2 處理的DHA 含量整體看來沒有顯著差異。在低溫處理后3 h 時，T2 處理的DHA 含量顯著高于CK；低溫處理后12 h 和24 h，T1 和T2 處理的DHA 含量顯著高于CK；而在低溫處理后72 h，T1 和T2 處理的DHA 含量顯著低于CK。

2.3 低溫脅迫下外施肌醇對黃瓜幼苗MDA、H2O2、和滲透物質含量的影響

隨著低溫處理時間的延長，黃瓜幼苗葉片中的MDA 含量呈持續升高的趨勢（表2），處理48 h 時，T1、T2 和CK 三者之間的MDA 含量差異顯著，與CK 相比，T1 和T2 處理的MDA 含量分別增加了103.03%和75.76%。低溫處理6～72 h，T1 和T2處理黃瓜幼苗葉片的H2O2含量顯著高于CK，且T1 處理在低溫后12～48 h 一直顯著高于T2 處理。低溫處理3～6 h 和24～72 h，T1 和T2 處理的含量顯著高于CK，在低溫處理48～72 h，T1 處理的含量顯著高于T2 處理。

低溫處理后黃瓜幼苗葉片中脯氨酸含量顯著高于CK，處理24 h 時T2 處理的脯氨酸含量顯著高于T1 處理，比T1 處理提高了155.50%。隨著低溫處理時間的延長，黃瓜幼苗葉片中可溶性蛋白含量呈先增加后降低的趨勢，T1 和T2 處理的可溶性蛋白含量從處理12 h 開始顯著高于CK。低溫處理下黃瓜幼苗葉片中可溶性糖含量整體呈增加的趨勢，在低溫處理24 h 和48 h，T2 處理的可溶性糖含量顯著高于T1 處理，分別比T1 處理高出54.62%和17.02%；在低溫處理72 h 時，T1 和T2 處理的可溶性糖含量與CK 相比分別提高了124%和149%，均與CK 差異顯著。

2.4 低溫脅迫下外施肌醇對黃瓜幼苗抗氧化酶的影響

如圖5 所示，與CK 相比，T1 和T2 處理的抗氧化酶活性均有提高的趨勢。在低溫處理后0～6 h 內，T1、T2 處理的SOD 和POD 活性沒有顯著差異；低溫處理24 h 后，T2 處理的SOD 和POD活性一直高于T1 處理，且24 h 時達到最高，并與T1 處理差異顯著；在72 h 時，T2 處理的POD 和CAT 活性顯著高于CK 和T1 處理，此時T2 處理的POD 和CAT 活性分別比CK 提高了62.44%和83.87%。

2.5 低溫脅迫下外施肌醇對黃瓜幼苗肌醇代謝相關基因表達水平的影響

由圖6-A 可見，低溫處理和外施肌醇能夠顯著影響肌醇代謝相關基因的表達水平。肌醇代謝相關酶有肌醇半乳糖苷合酶（Gols）、磷脂酰肌醇合酶（PIS）和肌醇加氧酶MIOX（Taji et al.，2002；Pendaries et al.，2005；Zhuo et al.，2012），其中肌醇加氧酶基因CsMIOX1迅速響應，低溫處理后3 h 其表達水平顯著高于其他基因，T2 處理的CsMIOX1基因相對表達量超出T1 處理的2 倍左右。對CsMIOX1基因進行低溫處理72 h 內水平變化分析發現（圖6-B），低溫脅迫處理3～12 h，CsMIOX1的相對表達量增加，且外施肌醇的T2 處理的CsMIOX1的相對表達量一直顯著高于T1 處理，3 h 時T2 處理CsMIOX1的相對表達量最大，與CK 相比，T1 處理和T2 處理的CsMIOX1表達量分別上升了3.68 倍和10.64 倍；12 h 時，T1、T2處理與CK 相比分別上升1.44、3.65 倍。在處理后期，T2 處理和T1 處理的CsMIOX1表達水平沒有顯著差異。說明低溫條件下外施肌醇能夠改變肌醇代謝基因的表達水平，其中CsMIOX1基因水平強烈響應低溫脅迫和噴施外源肌醇。

3 討論與結論

低溫脅迫是影響植物正常生長的不利因素之一，尤其是早春和冬季黃瓜設施栽培中，低溫是作物生長的主要限制因子。有研究發現外源肌醇能夠提高水稻低溫抗性（郭元飛 等，2014），但是肌醇在蔬菜作物上的應用研究鮮有報道。與常規噴施外源物質不同的是，肌醇是AsA 合成過程肌醇途徑的底物，說明肌醇除了作為滲透物質調節細胞滲透壓，還可以作為底物合成關鍵的抗氧化物質AsA（Valluru &Ende，2011）。AsA 作為植物逆境條件下產生的非酶抗氧化物質，在植物受到低鹽、臭氧、紫外線、低氮、低溫脅迫時含量提高（Zhang et al.，2016），AsA 能夠將H2O2還原為脫氫抗壞血酸（DHA），AsA 和DHA 在抗壞血酸-谷胱甘肽循環中相互轉化（許英 等，2015）。本試驗結果表明，整體來看，低溫脅迫下黃瓜幼苗中AsA 和T-AsA含量有所增加，且噴施肌醇可以進一步提高AsA及T-AsA 的含量。

本試驗中低溫處理初期，T1、T2 處理的黃瓜幼苗MDA、H2O2和含量顯著增加，但是二者沒有顯著差異。植物受到脅迫產生活性氧激活抗氧化酶系統，通過自身抗氧化酶活性來清除活性氧維持正常代謝（Miller，2004；Rubio et al.，2005），低溫處理開始階段噴施肌醇的T2 處理的抗氧化酶系統活性和滲透物質含量與未噴施肌醇的T1 處理沒有顯著差異。低溫處理12 h 時，T2 處理的AsA和T-AsA 含量最高，且顯著高于T1 處理；此時T2 處理的H2O2含量顯著低于T1 處理，但T1 和T2 處理的抗氧化酶系統活性還沒有顯著差異。低溫處理3 h 時，與CK 相比噴施肌醇的T2 處理的DHA 含量顯著增加，說明低溫開始后植株內已有的AsA 在清除活性氧之后被氧化為DHA（Noctor，2006）。低溫處理12～48 h 時，T2 處理的H2O2含量一直顯著低于T1 處理，從24 h 開始，T2 處理的SOD 和POD 活性才開始高于T1 處理，抗氧化酶活性的升高使植株抗性增加（錢恒彥 等，2019），此時T2 處理的脯氨酸和可溶性糖含量顯著高于T1處理；至低溫處理48 h 時，T2 處理的過氧化氫含量、含量、MDA 含量均顯著低于T1 處理，可能是由于植株累積的AsA 能夠清除活性氧，減少了抗氧化酶系統壓力，從而植株受低溫損傷較小。以上現象說明，在低溫處理開始后，外施肌醇的植株內迅速累積AsA，葉片吸收肌醇后生成更多的AsA（Lorence et al.，2004；Endres &Tenhaken，2009），這個結果與在轉基因番茄上飼喂肌醇提高了AsA 含量結果一致（Munir et al.，2020）。

有研究發現MIOX基因與抗性顯著相關。MIOX基因受環境脅迫調控，干旱條件誘導MIOX表達，過表達MIOX基因能夠提高植株抗氧化酶活性和抗堿性，在水稻中過表達OsMIOX能夠通過降低轉基因植株內自由基含量來提高水稻抗旱性（王海光 等，2007；Duan et al.，2012；Chen et al.，2015）。與野生型植株相比，過表達MIOX4擬南芥轉基因植株的AsA 含量提高了2～3 倍（Lorence et al.，2004）；飼喂肌醇后過表達MIOX轉基因擬南芥內肌醇含量一直低于野生型植株（Endres &Tenhaken，2009）。根據本試驗研究結果，低溫處理誘導黃瓜幼苗CsMIOX1表達，外施肌醇后肌醇加氧酶作用的底物增加，CsMIOX1進一步被誘導表達，從而生成更多抗壞血酸抵抗低溫脅迫，此結果與Munir 等（2020）的研究結果一致。

本試驗結果表明，低溫脅迫下外施肌醇能夠顯著增加植株干鮮質量，降低電解質外滲率，緩解低溫損害。肌醇作為底物生成更多抗壞血酸，抗壞血酸的累積能夠清除活性氧，抗氧化酶系統活性升高；此外，肌醇加氧酶基因表達水平在外施肌醇后顯著上升，進一步說明MIOX 發揮作用使肌醇生成了更多抗壞血酸。綜上所述，外施肌醇能夠提高黃瓜幼苗的抗壞血酸含量和抗氧化酶活性，提高植株的抗冷性。