橙色大白菜同核異質(zhì)細胞質(zhì)雄性不育系的分子鑒定與園藝性狀比較

王若凡 馬 帥 陳 霖 盧倩倩 孟 艷 張魯剛

（旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinesis（Lour）Olsson〕是我國廣泛栽培和食用的十字花科蔬菜之一，具有非常明顯的雜種優(yōu)勢。目前，大白菜雜交種制種主要是利用自交不親和系和雄性不育兩用系，但這兩種制種方法存在著雜交率低和制種麻煩的弊端。利用胞質(zhì)雄性不育系制種是作物雜種優(yōu)勢利用最經(jīng)濟有效的途徑，因此大白菜細胞質(zhì)雄性不育系的選育成為生產(chǎn)上迫切需要解決的問題。

大白菜細胞質(zhì)雄性不育主要分為大白菜波里馬甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育（Pol CMS）和蘿卜細胞質(zhì)雄性不育（Ogu CMS）兩種類型。細胞質(zhì)雄性不育性是由細胞核不育基因與細胞質(zhì)不育基因互作、共同控制的不能產(chǎn)生有活力花粉的母性遺傳性狀（徐一蘭 等，2006）。研究表明，orf138、orf222、orf224分別為Ogu 型蘿卜、Nap 型甘藍型油菜、Pol 型甘藍型油菜細胞質(zhì)不育類型的細胞質(zhì)基因（萬正杰 等，2006）。

在大白菜Pol CMS 的相關(guān)研究中，柯桂蘭等（1992）用大白菜3411-7 為父本轉(zhuǎn)育Pol CMS，最終獲得了大白菜胞質(zhì)雄性不育系CMS3411-7。楊曉云等（2006）以不結(jié)球白菜Pol CMS 為不育源，用大白菜自交系作轉(zhuǎn)育父本，通過雜交、多代回交及不育性選擇，育成穩(wěn)定性強、耐低溫的大白菜Pol CMS 不育系A(chǔ)7，并且已經(jīng)用于雜交種配制。但Pol CMS 在偏低溫度條件下常產(chǎn)生少量花粉，從而影響雜交種的純度。Ogu CMS 的研究雖然取得了很大進展，但還存在隨著轉(zhuǎn)育代數(shù)增加材料出現(xiàn)退化等問題亟需解決，因此該不育系未能廣泛用于生產(chǎn)之中（崔冰 等，2018）。此外，張德雙等（2002）從法國引進了甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育系材料CMS96，經(jīng)過多代回交轉(zhuǎn)育，成功地轉(zhuǎn)育出5 份不同類型的大白菜細胞質(zhì)雄性不育系，這些不育系材料不育性穩(wěn)定，具有較高的利用價值。

本試驗在前人研究基礎(chǔ)上，以西北農(nóng)林科技大學(xué)大白菜課題組選育的優(yōu)良橙色大白菜自交系15S1094 及其同核異質(zhì)不育系18C5、18C6 為研究對象，對保持系和不育系的植株性狀、花器形態(tài)等進行觀測、比較，鑒定細胞質(zhì)不育基因及不育系與保持系基因組的相似性，以期加深對這2 個胞質(zhì)不育系的了解，為研究其雄性不育機理及應(yīng)用于配制優(yōu)良雜交種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗使用的疊抱頭球型同核異質(zhì)橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系及其保持系均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院十字花科蔬菜作物遺傳改良技術(shù)創(chuàng)新實驗室培育而成（表1），不育源12XC5 為普通白菜，11-8 為大白菜。試驗材料于2018 年2 月和8月種植在西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌蔬菜試驗站，每份材料取3 個單株進行試驗。

表1 同核異質(zhì)橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系及其保持系

1.2 不育系不育細胞質(zhì)基因鑒定

1.2.1 試驗材料種植及DNA 提取 分別取各試驗材料種子20 粒進行浸種催芽，待種子露白時播種育苗；當(dāng)幼苗長至4～5 片真葉時移栽到大田；緩苗后，分別選3～5 株生長整齊一致的單株，取葉樣。采樣時，先將2 mL 的離心管滅菌，然后用鑷子取0.2 g 左右的葉片放入離心管中，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存。采用李榮華等（2009）提出的改進CTAB 法提取基因組DNA，提取時用磨樣器（Retsch MM400 球磨儀）磨樣。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，采用NanoDrop 2000c 微量紫外分光光度計檢測DNA 的質(zhì)量和濃度，統(tǒng)一稀釋到100 ng·μL-1作為PCR 擴增模板。

1.2.2 引物合成 選用已知的3 對細胞質(zhì)雄性不育基因擴增引物（表2）（王國芳 等，2014）進行鑒定，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 反應(yīng)體系及擴增程序 PCR 擴增反應(yīng)程序參照王國芳等（2014）的方法。擴增體系總體積為10 μL，其中包括2 ×TaqMaster Mix for PAGE（Vazyme）5 μL，模板DNA 1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，ddH2O 3 μL。

表2 鑒定細胞質(zhì)雄性不育基因的特異引物

1.3 不育系與保持系基因組DNA 一致性鑒定

1.3.1 DNA 的提取及檢測 提取及檢測方法同1.2.1。

1.3.2 引物合成 選用已知的28 對大白菜核心SSR 引物（隋光磊 等，2014）對橙色大白菜不育系及其保持系材料進行基因組一致性分析。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 反應(yīng)體系及擴增程序 擴增反應(yīng)程序參照隋光磊等（2014）的方法，擴增體系同1.2.3。

1.3.4 電泳檢測 擴增產(chǎn)物用濃度為12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳參數(shù)設(shè)置：電壓200 V，電流100 mA，時間2 h。電泳結(jié)束后，用0.1%硝酸銀染色5 min，1.5%氫氧化鈉和1%甲醛進行顯影，并拍照記錄。選擇清晰易辨的多態(tài)性帶型進行統(tǒng)計，在相同遷移率位置，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，缺失記為“—”。利用Excel 軟件計算不育系與保持系的遺傳相似系數(shù)（即不育系和保持系共有擴增條帶數(shù)占總擴增條帶數(shù)的比值），分析其遺傳相似率。

1.4 不育系與保持系花器比較觀察

2018 年冬季種植不育系及其保持系，2019 年春季開花，在盛花期晴天上午10：00 左右觀察不育系及其各自保持系的主花序花器官形態(tài)并測量。每種材料隨機取5 株，每株觀察6 朵花，利用游標(biāo)卡尺測量四強雄蕊長、兩弱雄蕊長、四強花絲長、花瓣長、花瓣寬、萼片長、雌蕊長、花柱長，觀察蜜腺大小、花藥形狀、花瓣形狀并拍照記錄，使用IBM SPSS Statistics 23 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

1.5 不育系與保持系植物學(xué)性狀觀察

2018—2019 年秋季種植不育系及其保持系，在結(jié)球初期和成熟期分別對不育系和保持系的相關(guān)性狀進行調(diào)查，蓮座期觀測葉色、葉緣鋸齒、葉緣波狀、絨毛密度、泡狀凸起數(shù)量、泡狀大小、葉色光澤度、葉脈等8 個性狀，成熟期測定株高、開展度、單株質(zhì)量、單球質(zhì)量、球高、球?qū)挕⑼馊~數(shù)等7 個性狀。從植物學(xué)性狀上統(tǒng)計比較不育系和保持系的一致性，具體標(biāo)準(zhǔn)參考《植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南—大白菜》（GB/T 19557.5—2004）。

株高為地上植株基部至植株最頂處的高度（cm），開展度為植株外葉開展縱、橫兩個垂直方向最大距離（cm），單株質(zhì)量為去除根部后的大白菜整株質(zhì)量（kg），單球質(zhì)量為去除外葉后的大白菜質(zhì)量（kg），球高為大白菜葉球底部至頂部的高度（cm），球?qū)挒榇蟀撞饲蚣缱顚挷课坏膶挾龋╟m），外葉數(shù)為成熟期葉球外綠色葉片數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系的不育細胞質(zhì)基因鑒定

利用3 對已知的細胞質(zhì)雄性不育基因特異引物，對參試不育系和保持系材料進行PCR 擴增，其中orf224的引物在3 份材料中均未擴增出產(chǎn)物；orf138的引物從18C5 和18C6 中均擴增出長度約300 bp 的片段，測序結(jié)果與orf138序列一致性為99%；orf222的引物僅在18C6 中擴增出700 bp 的條帶，測序結(jié)果與orf222的序列高度同源、一致性為99%（圖1）。說明18C5 僅含有orf138基因，應(yīng)該屬于Ogu 細胞質(zhì)雄性不育；18C6 同時含有orf138和orf222基因，簡稱Ogu-Nap CMS；3 對引物在保持系中均沒有擴增出產(chǎn)物，即保持系不含不育基因。

2.2 橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系與保持系細胞核DNA 相似性的分子鑒定

用已知的28 對大白菜核心SSR 引物對參試不育系和保持系的各3 個單株進行PCR 擴增，結(jié)果表明18C5 與保持系15S1094 的平均遺傳相似系數(shù)為91.11%，18C6 與保持系15S1094 的平均遺傳相似系數(shù)為93.76%（表3）。由此可知，18C6 與保持系15S1094 的遺傳相似性更相近。

表3 橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系與保持系的遺傳相似性分析

2.3 橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系與保持系花器比較觀察

2 個同核異質(zhì)不育系在春季開花早期低溫條件下均有敗蕾現(xiàn)象，但隨著溫度升高開花趨于正常。對花器觀測發(fā)現(xiàn)，不育系與保持系花色均為黃色；保持系開放花的柱頭略低于雄蕊，花絲較長，花藥呈近長方體，形態(tài)飽滿、有大量淡黃色花粉，雄蕊、蜜腺均正常；不育系18C5 的柱頭明顯高于雄蕊，雄蕊花絲短，花藥呈長錐體、干癟扁平，甚至退化成絲狀，無花粉；不育系18C6 的柱頭略高于雄蕊，雄蕊花絲較短，但較18C5 長，花藥呈錐體、無花粉。2 個不育系的蜜腺數(shù)量均正常，雖然18C5 的蜜腺較?。▓D2），但均可以吸引蜜蜂、蝴蝶，正常授粉結(jié)籽。

表4 橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的花器官性狀指標(biāo)

從表4 可以看出，2 個不育系的花瓣長、花瓣寬、四強雄蕊長、四強花絲長均小于保持系，且18C5 小于18C6，達到顯著或者極顯著差異水平；2 個不育系的兩弱雄蕊長均極顯著小于保持系，但2 個不育系之間差異不顯著；2 個不育系的花柱長和雌蕊長與保持系差異不顯著；2 個不育系的萼片長變化比較特殊，18C5 的萼片長大于保持系，而18C6 的萼片長小于保持系。這說明從不同不育源轉(zhuǎn)育來的2 個同核異質(zhì)不育系花器官的雌蕊沒有受到不育性的影響，而其他器官都不同程度變小，其中18C5 變小較18C6 更嚴重。

2.4 橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系與保持系植物學(xué)性狀比較

從圖3 和表5、6 可以看出，蓮座期，18C5 的葉色、葉緣鋸齒、絨毛密度、泡狀凸起數(shù)量、泡狀大小、葉色光澤度等6 個性狀都與保持系一致，18C6 的葉色、葉緣波狀、泡狀大小、葉色光澤度等4 個性狀與保持系一致，說明蓮座期18C5 與15S1094 更為相似；成熟期。18C6 的株高、開展度、球高、球?qū)?、外葉數(shù)均與保持系差異不顯著，但單株質(zhì)量與保持系的差異達到極顯著水平，單球質(zhì)量與保持系的差異達到顯著水平；18C5 的開展度、球高、球?qū)挕⑼馊~數(shù)均與保持系差異不顯著，但株高、單株質(zhì)量與保持系的差異達到極顯著水平，單球質(zhì)量與保持系的差異達到顯著水平，說明成熟期18C6 與保持系15S1094 更為相似。

表5 橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系與保持系的蓮座期性狀

表6 橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系與保持系的成熟期性狀

3 討論與結(jié)論

橙色大白菜富含類胡蘿卜素，對人類健康有益，因此培育橙色大白菜細胞質(zhì)雄性不育系對開展橙色大白菜雜種優(yōu)勢利用有重要意義。本試驗對疊抱頭球型橙色大白菜的同核異質(zhì)細胞質(zhì)雄性不育系的不育基因、雄蕊特征、植物學(xué)性狀進行了系統(tǒng)觀察，分析了2 個不育系的不育基因、雄蕊退化特征和植物學(xué)性狀的異同，加深了對這2 個細胞質(zhì)雄性不育系的了解。

細胞質(zhì)不育基因分子鑒定結(jié)果表明，18C5和18C6 攜帶不同的細胞質(zhì)不育基因，18C5 攜帶orf138不育基因，18C6 攜帶orf138和orf222不育基因，具有細胞質(zhì)多樣性特點。用大白菜基因組已知的28 對核心SSR 引物對18C5、18C6 及其保持系進行遺傳多樣性分析，18C5 和18C6 與保持系的平均遺傳相似系數(shù)分別為91.11%和93.76%，兩者差異不大，但均低于理論相似性96.875%，這可能是由于回交早期沒有進行植物學(xué)性狀選擇造成的。

對植株生育期性狀的觀測結(jié)果表明，2 個同核異質(zhì)不育系均花絲短縮、花藥干癟無花粉，不育性100%，雌蕊、蜜腺發(fā)育正常，能正常結(jié)籽，可以用于雜交制種。值得注意的是：蓮座期18C5 與保持系15S1094 的相似度更高；而在成熟期18C6 與保持系15S1094 的相似度更高，即2 個不育系不同發(fā)育時期與保持系相似度不同，表明Ogu 型蘿卜細胞質(zhì)雄性不育和Nap 型甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育對植物學(xué)性狀有不同的影響，同時發(fā)現(xiàn)2 個不育系的植物學(xué)性狀普遍較保持系有明顯優(yōu)勢，這可能是不育系核質(zhì)雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)，也可能是不育系的回交代數(shù)低或純合程度不夠所顯示的異核結(jié)合的雜交優(yōu)勢還在起作用。該雜種優(yōu)勢是否能遺傳到雜交種中尚不清楚；另外，Ogu 型蘿卜細胞質(zhì)雄性不育和Nap 型甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育對雜種優(yōu)勢是否有影響，也有待于進一步研究。