農藥殘留快速檢測酶抑制法局限性探討

（湘潭市農產品質量安全檢測管理站，湖南湘潭 411100）

農藥殘留快速檢測酶抑制法操作簡單、方便快捷、成本低廉，但同時存在假陽性及假陰性率高、檢出限高、靈敏度低、檢測農藥種類有限等局限性。隨著人們對農產品質量安全的要求越來越高，國際和國內食品中農藥殘留限量標準也越來越嚴格，酶抑制法已不適合作為農藥殘留檢測的主要手段及篩查手段，不應再大力推廣使用。

農藥殘留是指使用農藥一定周期后，仍殘留于農作物、生物體、土壤、水體、大氣中的微量農藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質的統稱。酶抑制法是依據有機磷類及氨基甲酸酯類農藥可以特異性地對膽堿酯酶活性產生抑制的原理，將膽堿酯酶與樣品提取液作用，在檢測體系中加入底物和顯色劑，采用分光光度計檢測吸光度隨時間的差值，得出抑制率的結果，來判斷是否存在有機磷類或氨基甲酸酯類農藥殘留超標（李穎暢 等，2013）。酶抑制法的優點是操作簡便，對操作人員技術水平要求不高，成本消耗及后期儀器維護費用均較低，且檢測速度快，一般15～30 分鐘就可以得出結果，因而酶抑制法已被廣泛地使用和推廣。目前，在農業生產領域和流通環節大多使用酶抑制法對蔬菜開展日常監管，主要應用于農產品物流中心、農業合作社、生產基地、大型超市配送中心和基層檢測中心等（胡蓉，2013；黃建平和房新艷，2018）。但該檢測方法存在假陽性、檢出限高、靈敏度低、檢測農藥種類有限等局限性，可能會出現農殘漏檢和誤檢的情況，甚至存在貿易壁壘的風險，不僅影響消費者食用農產品質量安全，甚至還可能嚴重影響農產品的對外貿易。錢允輝等（2008）從酶的來源、植物組織液的干擾、酶促條件等3 個方面分析了酶抑制法出現重現性差及假陽性的原因。王潔蓮（2011）也從酶的選擇、酶促反應、某些農產品易產生假陽性及測定農藥種類有限等4 個方面探討了酶抑制法在實際應用中存在的問題。檢測方法、檢測農藥種類、樣品基質、結果重復性是反映方法準確性、適用性的關鍵因素，本文從這4 個方面討論酶抑制法對農藥殘留快速檢測的局限性，以期正確認識酶抑制法在農藥殘留檢測中存在的問題。

1 檢測方法分析

近年來，食品中農藥殘留限量標準越來越嚴格。現行有效的國家推薦標準GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測》指出，酶抑制法檢測對禁用農藥甲胺磷、對硫磷的檢出限分別為2.0、1.0 mg·kg-1。農業行業推薦標準NY/T 448—2001《蔬菜上有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測方法》指出，酶抑制法檢測對禁用農藥甲胺磷、對硫磷的檢出限分別為3.0～5.0 mg·kg-1和2.0～4.0 mg·kg-1。而我國最新農藥殘留限量標準GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》規定，甲胺磷除蘿卜外，在其他蔬菜中允許最大殘留限量為0.05 mg·kg-1；對硫磷在蔬菜中允許最大殘留限量為0.01 mg·kg-1（表1）。通過比較，可見酶抑制法檢測農藥殘留甲胺磷、對硫磷的檢出限比我國允許的最大殘留限量分別高了40 倍和100 倍，無法滿足我國農藥殘留限量標準的要求，即可能會存在漏檢。

酶抑制法無法靈敏地檢測蔬菜中所有有機磷類和氨基甲酸酯類農藥，葉雪珠等（2013）比較了4種不同型號的農殘速測儀使用酶抑制法檢測蔬菜中不同農藥殘留的有效性，結果表明不同農藥靈敏度相差很大，高毒農藥克百威、滅多威的檢出限相對較低，分別在0.003～0.1 mg·kg-1和0.01～0.5 mg·kg-1，而GB 2763—2019 中最大殘留限量值分別為0.02（除馬鈴薯外）、0.2 mg·kg-1；氧化樂果、久效磷、甲胺磷、磷胺的靈敏度在1 mg·kg-1以上，遠高于GB 2763—2019 中最大殘留限量值0.02、0.03、0.05～0.1、0.05 mg·kg-1；水胺硫磷、對硫磷、甲基對硫磷、甲拌磷在酶抑制法中均不靈敏。中毒農藥中，甲萘威在酶抑制法中靈敏度較高，在0.01～0.5 mg·kg-1，基本滿足GB 2763—2019 中最大殘留限量（0.02～0.05 mg·kg-1）；而蔬菜中檢出率較高的三唑磷、毒死蜱等在酶抑制法中靈敏度卻很低。因此，酶抑制法檢測可能會造成假陰性率偏高，作為執法依據結果精確度不夠。

表1 酶抑制法在GB/T 5009.199—2003、NY/T 448—2001 中的檢出限與在GB 2763—2019 中的最大殘留限量比較

2 檢測農藥種類分析

農藥種類繁雜，按化學結構可歸納為有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、三唑類、雜環類、酰胺類、脲類、醚類、苯甲酸類等。酶抑制法只對有機磷類和氨基甲酸酯類農藥有效，對其他類農藥無法得出定量和定性的結果（王志波，2009）。

2019 年10—11 月，采用色譜法對湖南省14個市州的63 個基地、20 個超市、25 個市場的主要農產品質量安全開展風險監測，檢測了葉菜類、豆類、茄果類、瓜類等10 類35 種蔬菜中的68 種農藥殘留，結果表明在抽取的980 批次蔬菜樣品中，禁限用農藥累計檢出13 次和6 次超標；禁用農藥中檢出甲胺磷2 次，限用農藥中毒死蜱、克百威、氧化樂果分別有3、2、1 次超標；常規農藥檢出率高，累計檢出595 次，多菌靈、啶蟲脒、吡蟲啉、烯酰嗎啉、滅蠅胺、霜霉威、吡唑醚菌酯等分別檢出78、103、32、71、41、44、34 次，雖未超標，但存在風險隱患。說明目前常用的農藥已不僅僅是有機磷類及氨基甲酸酯類，還有一些高效低毒的新型農藥，如多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑，吡蟲啉、啶蟲脒等煙堿類殺蟲劑，嘧菌酯、吡唑醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。推廣使用高效低毒低殘留的化學農藥是現階段及未來農藥發展的趨勢（李軍明 等，2010；趙鑫 等，2013）。酶抑制法對現階段使用率高的大部分農藥品種是無效的，不適合作為快速篩查的手段，否則可能會存在漏檢。

3 樣品基質分析

酶抑制法主要適用于蔬菜，不能廣泛適用于水果和茶葉。因為水果中含有較多的色素和果汁，對顯色反應產生干擾，同時果皮的厚度對酶抑制法的檢測結果也有很大影響（張立新，2016）。對于茶葉類樣品，基質復雜干擾大，含有茶多酚、色素、咖啡堿、氨基酸、多糖、茶皂素、維生素、礦物質、蛋白質、脂質等（傅杭英，2013），不同成分對水的溶解性又不一樣，因此不能簡單地像蔬菜一樣直接用磷酸緩沖液提取，必須用有機溶劑如丙酮、乙酸乙酯、乙腈等充分提取，凈化后才能得到待測液。即便是對蔬菜的農殘檢測，也無法全覆蓋。一方面某些蔬菜因產生對酶有抑制作用的植物次生物質，易引起假陽性。另一方面由于酶抑制法是以吸光度變化值來判斷，而植物體內的葉綠素、胡蘿卜素、花青素、氧化酶次生物質等會對酶產生干擾，引起反應液顏色變化，影響檢測結果的專一性、準確性、可比性等（陸自強 等，2004；杜美紅 等，2010；王芳 等，2015）。因此，使用酶抑制法要避免檢測蔥、蒜、韭菜、蘿卜、芹菜、芫荽、茭白、番茄等。

4 結果重復性分析

由于酶的結構具有復雜性與多樣性，檢測結果與酶活性、酶和底物的濃度、取樣部位、反應溫度及時間、反應液的澄清度、pH 值等密切相關，因此檢測結果可能存在較大誤差，重復性不理想。酶是一種特異性蛋白質，酶促反應要求較為嚴格，pH 值、反應溫度、氧化還原電位等都是影響酶促反應的主要因素。此外，酶的貯存、顯色劑的選擇與穩定性、酶和底物的濃度等都可能影響檢測結果（楊東鵬 等，2004）。羅俊霞等（2015）研究表明，使用酶抑制法在不同時間對同一樣品進行檢測，重現性也較差。由此可見，以上影響因子的控制與否，都可能會影響檢測結果的重復性。

5 結論與展望

隨著人們生活質量的提高以及對綠色健康食品的需求，國際和國內食品中農藥殘留限量標準也越來越嚴格，因此對檢測技術的要求也越來越高。本文從檢測方法、檢測農藥種類、樣品基質、結果重復性4 個方面探討酶抑制法對農藥殘留檢測的局限性：從檢測方法看，酶抑制法的檢出限高，無法滿足我國農藥殘留限量標準的要求；從檢測農藥種類看，酶抑制法無法檢測除有機磷類及氨基甲酸酯類以外的其他種類農藥；從樣品基質看，酶抑制法主要適用于蔬菜類，但部分蔬菜種類易產生假陽性，可能導致“誤檢”；從結果重復性看，酶的結構具有復雜性與多樣性，導致檢測結果可能存在較大誤差，重復性不理想。因酶抑制法存在假陽性及假陰性率高、檢出限高、靈敏度低、檢測農藥種類有限等局限性，現階段已不適宜作為農藥殘留檢測的主要手段及篩查手段。如何進一步提高酶抑制法的檢測靈敏度，降低檢出限，克服樣品基質的影響，擴大檢測農藥范圍，滿足國家限量標準，一直是國內外專家亟待解決的難題。建議有條件的實驗室盡快開展色譜法檢測分析，使用氣相、氣質、液相、液質等大型精密儀器進行檢測。近年來逐漸發展起來的氣質、液質QuECHERS 法因前處理技術快速、簡單、廉價、有效、可靠、安全的特點成為未來農藥殘留檢測發展的方向及趨勢。