聚乳酸-羥基乙酸共聚物載腦源性神經生長因子納米粒的構建及生物學活性評價

李洋，余江南，徐希明

(江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013)

脊髓損傷是常見的中樞神經系統損傷疾病，對患者身心均造成嚴重創傷。其發病率高、繼發反應復雜、治愈率低，一直是全世界范圍內急需攻克的醫學難題[1]。目前的治療策略主要是抑制膠質瘢痕的產生、促進神經細胞再生以及重構創傷部位的微環境[2-3]。已有報道腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)對脊髓損傷有明顯的修復作用[4-5]。BDNF通過作用于全長型酪氨酸受體激酶B發揮神經保護、炎性因子調節等作用[6-7]。然而BDNF在體內易失活從而難以發揮持續滋養受損部位的作用，因此構建BDNF緩釋釋藥體系有利于藥物應用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic acid-glycolic acid),PLGA]是組織工程領域中應用廣泛的生物材料[8]，具有良好的生物相容性[9]，PLGA納米粒可提高生長因子的穩定性以及實現藥物的緩釋[10]。

本研究采用復乳化溶劑揮發法制備BDNF-PLGA納米粒，利用正交試驗設計優化制備工藝，最后對制得樣品進行表征及生物相容性評價。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

PLGA(75∶25)相對分子質量為24 000～38 000(濟南岱罡生物科技有限公司)；聚乙烯醇，相對分子質量13 000～23 000(日本可樂麗公司)；甘露醇、蔗糖(國藥試劑)；超高速離心機(美國 Beckman公司)；冷凍干燥機(德國CHRIST公司)；動態光散射及Zeta電位測定儀(德國Bruke公司)；透射電鏡(日本日立公司)；BCA蛋白定量試劑盒及BDNF-ELISA試劑盒(南京福麥斯生物技術有限公司)；BDNF(美國Peprotech公司)；酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2 BNDF-PLGA納米粒的制備

配制二氯甲烷/丙酮=3∶1(體積比)混合溶液，稱取PLGA粉末，溶解于上述溶液中，獲得PLGA溶液。精密稱取蛋白藥物，加入1 mL滅菌水配制成水溶液，按蛋白溶液/PLGA溶液=1∶5(體積比)，緩慢將蛋白水溶液滴加入PLGA的混合溶液中制得初乳，滴加過程中磁力攪拌使之分散均勻，然后100 W超聲2 min，然后攪拌轉移至聚乙烯醇溶液中，超聲分散至溶液顯乳白色。敞口磁力攪拌4 h揮干有機溶劑。離心清洗3次，將微球分散于20 mL超純水中，冷凍干燥后備用。

1.3 正交試驗優化BNDF-PLGA納米粒的制備條件

以牛血清白蛋白(BSA)為模型藥物，選取4個對PLGA納米粒制備結果影響較大的因素：A為制得初乳與聚乙烯醇溶液的體積比；B為投藥量與PLGA用量質量比；C為外水相聚乙烯醇溶液的質量濃度(g/L)；D為超聲時間(min)。以載藥率(S1)、包封率(S2)作為指標，優化制備工藝。正交設計見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.4 BNDF-PLGA納米粒的表征

1.4.1 平均粒徑、粒徑分布和Zeta電位的測定 將制備的納米粒加入雙蒸水中，分散均勻至無明顯渾濁，置于動態光散射及 Zeta 電位測試儀測定粒徑大小和Zeta電位。

1.4.2 納米粒的形態考察 將稀釋好的樣品滴于銅網上，用質量濃度為30 g/L的磷鎢酸溶液負染3 min，室溫干燥后于透射電鏡下觀察PLGA納米粒的內部結構。

1.5 PLGA納米粒中藥物包封率、載藥率和回收率的測定

1.5.1 包封率測定 收集制備過程中離心的上清液，按“1.5.3”所述方法測量其中未包載的藥物量，計算出納米粒的包封率。系統中上清液中的藥物含量記作W1，投入藥物總量記作W0，則包封率=(W0-W1) / W0×100%。

1.5.2 載藥量測定 稱取5 mg的納米粒，加入1.0 mL二氯甲烷溶解納米粒釋放藥物，再用1.0 mL滅菌水萃取納米粒中的蛋白質，加入0.5 g無水硫酸鈉顆粒，離心萃取上清液3次，收集3次的萃取液。測定其中蛋白的含量。

1.5.3 樣品含量的測定 采用BCA法檢測BSA含量。配制系列濃度蛋白標準品溶液，96孔板中加入稀釋好的待測樣品和標準品溶液，加入測定工作液后混合均勻，避光37 ℃孵育30 min，于波長562 nm處檢測光密度(D)值。以D值(Y)對標準品濃度(X)作線性回歸，得標準曲線并計算樣品對應濃度。配制濃度為 5、30、100 μg/mL的BSA溶液各3份，按照BCA法相同步驟操作，于562 nm測定D值，計算回收率。

BDNF含量采用ELISA試劑盒檢測，在包被有BDNF抗體的酶標板中加入標準品和樣品，設空白對照孔，于37 ℃孵育30 min，洗板后除空白孔外，均加入酶標試劑置于37 ℃孵育30 min，再次洗板拍干，加入顯色液A瓶、B瓶，避光37 ℃孵育15 min，最終加入終止液，測定波長450 nm處D值。以D值對標準品濃度(C)作線性回歸，得標準曲線并計算樣品對應濃度。

1.6 PLGA納米粒體外釋放度的測定

精密稱取制備的PLGA納米粒2 mg，用PBS稀釋后，置于透析袋中進行體外釋放試驗。恒溫水浴振蕩器設定為37 ℃，100 r/min，于4、6、12、24、48、72、168、240、288、360 h等時間點取樣，并補回等量緩沖鹽溶液。BSA-PLGA納米粒和BDNF-PLGA納米粒按照“1.5.3”中操作步驟測定含量，并作累積釋放曲線圖。

1.7 PLGA納米粒細胞相容性測定

1.7.1 細胞培養 將大鼠外胚層間充質干細胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)按 3×105個/瓶培養于含有5 mL細胞培養液、10%胎牛血清的D/F12培養液中，置于CO2培養箱(飽和濕度95%、5%CO2、37 ℃)孵育。根據細胞生長狀況以及培養液pH 值變化，1～2 d換液1次，待細胞培養至對數生長期時進行傳代。

1.7.2 細胞增殖實驗 細胞于96孔板中貼壁培養后，更換為含有PLGA納米粒的新鮮培養基，在規定的時間點，孔中細胞用PBS洗滌2次，在37 ℃下用含10% Alamar Blue的新鮮培養基避光孵育4 h。在波長590 nm處測量上清液的D值，以第1天的D值為基礎計算相對增殖速度。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 正交試驗設計結果

以制備納米粒的包封率(S1)和載藥量(S2)為指標，S=S1+S2。運用L9(34)正交表進行實驗設計，結果如表2所示。由極差分析可知，各因素的影響大小為B>C>A>D，且由表3中方差分析的結果可知，影響因素A、B、C對制備結果有顯著影響(P<0.05),而D因素影響不顯著。最佳的制備條件為A3B3C1D3，即制備初乳和外水相的體積比為1∶15，投藥量與PLGA用量質量比為6∶100，聚乙烯醇溶液的質量濃度為10 g/L，超聲時間為5 min。

表2 正交試驗設計和結果

表3 方差分析

2.2 最佳工藝驗證

按2.1項中優化的最佳處方工藝平行制備3批BSA-PLGA納米粒，按照BSA試劑盒中蛋白含量的測定方法，得標準曲線為Y=0.000 2X+0.068(R2=0.992 1)，計算出包封率為(78.65±3.18)%，載藥量為(3.25±0.71)%，回收率為(98.48±0.20)%。

2.3 BDNF-PLGA納米粒表征結果

透射電鏡結果顯示BDNF-PLGA納米粒形狀規整，呈均勻球形包載藥物，如圖1(A)所示；經動態光散射及Zeta電位儀測定，BDNF-PLGA納米粒粒徑為(205±0.18)nm，粒徑分布圖見圖1(B)，多分散系數為(0.132±0.02)，電位為-23.51 mV。BDNF含量測定標準曲線為D=0.042 2C+0.090 5(R2=0.990 4)，計算得出納米粒的包封率為(79.65±2.14)%，載藥量為(0.002 381±0.000 253)%。

2.4 載藥納米粒的體外釋放曲線

BSA-PLGA納米粒和BDNF-PLGA納米粒的釋放結果如圖2所示。前4 h兩種納米粒的累積釋放率分別為(18.23±2.31)%、(17.48±2.22)%，未出現突釋效應；在6～72 h內，BSA-PLGA納米粒和BDNF-PLGA納米粒每小時藥物釋放率為0.60%和0.50%，表現為緩慢釋放；72～360 h時納米粒釋放趨近平緩，最終兩者累積釋放率分別為(82.15±1.23)%和(88.32±1.23)%。

A：BDNF-PLGA透射電鏡圖；B：BDNF-PLGA納米粒粒徑分布

圖2 載藥納米粒體外累積釋放曲線

2.5 納米粒的細胞增殖實驗

如圖3所示，前24 h內BDNF-PLGA納米粒組、BDNF溶液組及空白對照組細胞增殖速率無顯著性差異(P>0.05)；隨后BDNF-PLGA納米粒和BDNF溶液均顯示出促進細胞增殖的作用，與對照組相比有統計學意義(P<0.05)，但納米粒組與BDNF溶液組無顯著差異。結果表明BDNF-PLGA納米粒能促進EMSCs增殖。

*：P<0.05,與對照組比較

3 討論

BDNF具有促進干細胞向神經元分化、抑制炎癥反應、促進神經元存活和改善軸突再生的作用[11-12]。已有不少報道其用于修復動物脊髓損傷模型[13-14]。然而蛋白類的藥物易失活，穩定性差，不利于在損傷處長期而持續地發揮療效[15]。PLGA是常見的生物可降解材料，其應用形式主要有薄膜、多孔支架、微球及納米粒等。PLGA的降解產物二氧化碳、水和羥基乙酸無毒害作用，可排出體內，并且可通過對材料的改性和修飾[16]，達到緩釋[17]、控釋藥物[18]的目的，是構建新型藥物遞送系統的理想材料。

目前，制備PLGA納米粒的常用方法有單/復乳溶劑揮發法、同軸靜電噴霧法、納米沉淀法等。其中復乳化溶劑揮發法操作簡便，易于重復，可用于親水性藥物如蛋白質類藥物的制備[19]。本實驗采用復乳化法制備BDNF-PLGA納米粒，可減少蛋白質類藥物的失活。

本研究通過正交試驗設計優化PLGA納米粒的制備工藝，以藥物包封率和載藥量為評價指標，方差分析結果顯示，初乳和外水相的體積比、投藥量與PLGA用量質量比、聚乙烯醇溶液濃度是影響納米粒制備的主要因素，超聲時間對結果的影響不顯著。根據正交試驗結果顯示，投藥量與PLGA用量質量比對藥物的包封率和載藥量影響較大。一方面PLGA占比越大，可增加有機相的黏度從而抑制藥物彌散；另一方面，增加PLGA用量加速微球的固化，可減少包載藥物的流失[20]。外水相聚乙烯醇溶液的作用主要是固化制備的初乳，沉淀出粒徑均一的納米粒。聚乙烯醇濃度不足可能導致乳液破相而使載藥量降低。此外，已有報道證明[21]，調節初乳/外水相的比例對制備樣品的載藥量和包封率有顯著影響，并可降低藥物的突釋現象。提高外水相的比例，可起到稀釋溶劑的效果[22]。綜合極差分析與方差分析所得最優制備條件為初乳和外水相的體積比為1∶15，投藥量與PLGA用量質量比為6∶100，聚乙烯醇溶液質量濃度為10 g/L。

通過對優化條件進行驗證，實驗所制備的BDNF納米粒形態粒徑均一，有較高的包封率，滿足后續實驗要求。制得樣品形態完整，在對納米粒釋放藥物能力的研究中，前4 h未出現藥物泄露而導致突釋效應；中期隨著外層載體PLGA的逐漸溶解，內層藥物BDNF逐漸擴散至介質中，直至最后平穩達到釋放平衡，累積釋放率為(88.32±12.3)%。乳化法制備PLGA納米粒包載蛋白藥物的包封率有限，不少研究者在制備該劑型時包封率不高，如趙鶯歌[23]制備胰島素的PLGA緩釋納米粒，包封率僅為36.61%；不僅如此，制備其他非蛋白類的藥物如熊果酸[24]、磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制劑阿普斯特(Apremilast)[25]等，所獲得的包封率也僅為約54%、61.1%。本實驗通過考察影響納米粒包封率的幾個因素，進行正交設計優化后，最終制得包封率為79.65%的納米粒，與以往的研究相比有較大的提升。

細胞增殖實驗結果表明BDNF納米粒對細胞的生長增殖無抑制作用，可維持EMSCs細胞的正常生長，說明BDNF納米粒具有良好的生物相容性。

綜上所述，本實驗通過復乳化溶劑揮發法制備BDNF-PLGA納米粒，并利用正交試驗設計優化制備工藝，最終制得的樣品性質穩定。經體外研究顯示，BDNF-PLGA納米粒具有緩釋效果和良好的生物相容性。然而本研究僅對BDNF-PLGA納米粒的制備工藝和性質進行了探討，后續將進一步探討其在干細胞分化以及脊髓損傷修復中的應用價值。