病毒宏基因組學(xué)在新發(fā)病毒快速確認(rèn)中的優(yōu)勢(shì)

張文，代紫苑，鮑思雯，茅慶慶

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

自然界中存在著數(shù)量龐大的未知新型病毒種類(lèi)，而人類(lèi)認(rèn)知的病毒只占所有潛在病毒類(lèi)型的0.1%[1]，這些潛在的未知新型病毒極易造成新發(fā)病毒感染性疾病。研究人員經(jīng)過(guò)實(shí)地調(diào)查研究結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，認(rèn)為哺乳動(dòng)物體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)的未知病毒有近百萬(wàn)種[1-2]。傳染病專(zhuān)家預(yù)計(jì)在未來(lái)相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，人類(lèi)新發(fā)傳染病的病原體將主要來(lái)自動(dòng)物體攜帶的未知新型病毒[3]。隨著科學(xué)技術(shù)、工農(nóng)業(yè)和交通工具的快速發(fā)展，人類(lèi)和資源的流通及人類(lèi)接觸自然領(lǐng)域的速度和頻率迅速提高，這導(dǎo)致新發(fā)傳染病的發(fā)生案例逐年增多。近30年來(lái)全球出現(xiàn)的新發(fā)傳染病達(dá)100多種，并以每年新發(fā)2～3種的態(tài)勢(shì)發(fā)展，對(duì)人類(lèi)健康危害巨大，已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[4]。從近年來(lái)新發(fā)或再發(fā)的傳染病案例來(lái)看，其病原體多為病毒，如2020年全球爆發(fā)感染的SARS-CoV-2[5-6]，頻繁爆發(fā)的新型禽流感病毒(avain influenza virus)[7]、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)[8]、寨卡病毒(Zika virus)[9]等。此外，臨床上尚有一些不明病因急性或慢性感染性疾病，給特異性診療帶來(lái)巨大困難。如臨床急性或慢性胃腸道疾病中有近40%的病例無(wú)法查出病因[10-11]，有10%～20%的急性肝炎及30%的隱發(fā)性慢性肝病的病原體尚不明確[12-14]；其中有些臨床不明病因的感染性疾病已經(jīng)被證實(shí)與新發(fā)病毒的感染有關(guān)[15-17]。新發(fā)病毒的感染具有不可預(yù)知性且不易被傳統(tǒng)方法檢出，對(duì)此人類(lèi)還沒(méi)有有效的早期防治措施。因此，新發(fā)病毒性病原體的快速確認(rèn)技術(shù)對(duì)于臨床治療及疫情防控至關(guān)重要[8]。

目前，臨床上傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)方法主要包括基于病毒基因的各類(lèi)(RT-)PCR和基于病毒抗原抗體的血清學(xué)檢測(cè)。但這些方法的局限性是要提前預(yù)知病毒的基因序列或蛋白質(zhì)序列信息，因此只能用于檢測(cè)已知病毒或變異幅度較小的毒株，而對(duì)于變異度較大或未知新型病毒則不能有效檢出。對(duì)于未知新型病毒，科研工作者可以用傳統(tǒng)的組織細(xì)胞培養(yǎng)法或電鏡觀察法確認(rèn)其病原學(xué)特征，但這些方法也有其不可克服的局限性，其中細(xì)胞培養(yǎng)法只能針對(duì)部分病毒，且新型病毒的容納細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)難以確定。而電鏡法則耗時(shí)耗力、靈敏度較低且不易定性鑒定病毒。近年來(lái)，隨著病毒分子生物學(xué)和下一代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)等技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新的病毒高通量檢測(cè)方法被應(yīng)用到未知新型病毒的挖掘中，其中病毒宏基因組學(xué)技術(shù)越來(lái)越成為人類(lèi)獵取未知病毒的高效工具[18-20]。

1 病毒宏基因組學(xué)原理

宏基因組也稱(chēng)微生物環(huán)境基因組，由Handelsman等于1998年提出，其定義為環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和[21]，包括可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因，目前主要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌的基因組總和。與細(xì)菌和真菌相比，病毒的顆粒及基因組均遠(yuǎn)小于它們。在傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)研究中，病毒基因序列由于占比太小或被淹沒(méi)在海量的真菌及細(xì)菌基因序列中，難以被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行分析。因此傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)分析方法無(wú)法用來(lái)進(jìn)行病毒群落分析[22]。病毒宏基因組學(xué)在宏基因組學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，主要用來(lái)解析特定環(huán)境或生物樣品中的病毒組，其概念由Edwards等[23]在2005年首次提出。隨后，美國(guó)加州大學(xué)的Delwart教授及美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Lipkin教授對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)和發(fā)展，使該技術(shù)更加適用于大多數(shù)已知病毒和未知新型病毒的快速鑒定[2,22]。利用該技術(shù)，科研人員已經(jīng)能夠檢測(cè)出可以感染人類(lèi)及其他脊椎動(dòng)物的病毒類(lèi)型如圖1所示。除了人類(lèi)及其他脊椎動(dòng)物的病毒群落，該技術(shù)在大氣、土壤、植物病毒群落及噬菌體群落解析方面也有了大量的應(yīng)用[20,22,24-25]。

該研究技術(shù)利用了病毒顆粒的兩個(gè)典型特征，即病毒顆粒小且核酸有致密的蛋白質(zhì)衣殼保護(hù)。基于此特點(diǎn)，可以利用微孔濾膜過(guò)濾的方法將樣品中真核及原核細(xì)胞與病毒顆粒分離開(kāi)來(lái)，進(jìn)而利用核酸消化酶(包括RNA酶和DNA酶)去除濾液中游離的非病毒衣殼保護(hù)的核酸，使樣品內(nèi)病毒核酸占比顯著提高，從而可以利用下一代測(cè)序技術(shù)充分獲得樣品內(nèi)的病毒核酸信息。因此，病毒宏基因組學(xué)摒棄了傳統(tǒng)宏基因組學(xué)對(duì)病毒組學(xué)研究的缺陷，可直接鑒定病毒群落的遺傳物質(zhì)，不需要預(yù)先進(jìn)行病毒基因序列特異性擴(kuò)增。其測(cè)序技術(shù)早期通過(guò)一代測(cè)序技術(shù)(Sanger法)獲得病毒基因序列，隨后迅速發(fā)展到通過(guò)下一代測(cè)序來(lái)分析包括人類(lèi)和動(dòng)物糞便、血液、組織和呼吸道分泌物等樣本內(nèi)的所有病毒序列組成。病毒宏基因組學(xué)中所謂“深度測(cè)序”主要集中在發(fā)現(xiàn)病毒及識(shí)別未知新型病毒或?qū)σ阎《镜淖儺愵?lèi)型進(jìn)行研究，以更好地了解它們的遺傳及進(jìn)化規(guī)律，從而達(dá)到對(duì)病毒群落進(jìn)行無(wú)偏好性識(shí)別，且消除了在細(xì)胞培養(yǎng)中預(yù)先擴(kuò)增后病毒多樣性降低的影響。例如，本次新冠病毒肺炎暴發(fā)感染之初，世界首個(gè)SARS-CoV-2全基因組序列便是通過(guò)病毒宏基因組學(xué)方法獲得[5]。

2 病毒宏基因組學(xué)技術(shù)流程

病毒宏基因組學(xué)分析流程主要包括樣品內(nèi)病毒核酸富集、文庫(kù)構(gòu)建、下一代測(cè)序、生物信息學(xué)分析幾個(gè)主要步驟，加上后期新發(fā)病毒與特定疾病關(guān)聯(lián)性驗(yàn)證，其詳細(xì)分析技術(shù)路線如圖2所示。

2.1 病毒核酸富集

由于絕大多數(shù)病毒的基因組遠(yuǎn)小于真核及原核生物基因組，如果事先不進(jìn)行病毒核酸富集而直接對(duì)臨床樣本進(jìn)行核酸測(cè)序，將導(dǎo)致真核及原核遺傳物質(zhì)(包括游離基因組序列和核糖體RNA序列)的背景較高[26]。為了減少這類(lèi)背景噪音，可以使用微孔濾膜(包括0.45 μm)過(guò)濾方法來(lái)純化病毒，以排除較大的其他大型顆粒。過(guò)濾后的濾液通過(guò)核酸酶(包括RNA酶和DNA酶)消化大量存在于臨床樣本中的裸露細(xì)胞核酸，病毒核酸因被病毒衣殼保護(hù)而不被核酸酶消化。當(dāng)樣本體積較大時(shí)，例如在環(huán)境研究中，也可以使用超速離心方法從預(yù)期密度帶中濃縮和提純病毒顆粒[27]。

2.2 文庫(kù)構(gòu)建及下一代測(cè)序

經(jīng)過(guò)上述處理步驟之后，盡管樣品內(nèi)病毒核酸的相對(duì)占比大幅度提高，整個(gè)樣品內(nèi)核酸的絕對(duì)濃度卻會(huì)顯著降低。因此，在病毒宏基因組學(xué)研究中，不管使用基于哪種測(cè)序方法進(jìn)行基因文庫(kù)的構(gòu)建，病毒核酸都需要進(jìn)行擴(kuò)增，才能產(chǎn)生下一代測(cè)序平臺(tái)所需的大量DNA。對(duì)于RNA病毒，則首先需要將其RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。各種不依賴已知序列的DNA擴(kuò)增方法已經(jīng)被成功地使用，其中隨機(jī)引物法目前占據(jù)主導(dǎo)地位。該方法將隨機(jī)引物(通常為6堿基隨機(jī)引物)放置在特定標(biāo)簽序列的3′端，隨機(jī)引物的簡(jiǎn)并性允許引物在病毒RNA或DNA基因組的整個(gè)長(zhǎng)度內(nèi)退火[24]。將這樣的引物放置在病毒序列的兩端進(jìn)行兩輪延伸之后，再用其攜帶標(biāo)簽序列作為引物進(jìn)行多輪PCR擴(kuò)增，即可獲得大量病毒DNA，然后再通過(guò)特定方式加上適用于下一代測(cè)序的接頭序列進(jìn)行深度測(cè)序。近年來(lái)，單引物等溫?cái)U(kuò)增(single primer isothermal amplification,SPIA)和多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification,MDA)兩種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也在病毒宏基因組學(xué)研究中大量使用，特別是針對(duì)特定目的病毒(如呼吸道樣品內(nèi)的SARS-CoV-2)的核酸檢測(cè)方面取得了良好的效果[28]。

羅氏公司454測(cè)序系統(tǒng)是最早用于未知新型病毒挖掘的高通量測(cè)序工具。該測(cè)序方法可產(chǎn)生較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，其單個(gè)讀長(zhǎng)可達(dá)到500 bp，這便于識(shí)別高度變異的病毒序列[29]。隨后，Illumina公司下一代測(cè)序分析平臺(tái)由于兼具讀長(zhǎng)(單個(gè)讀長(zhǎng)可達(dá)300 bp)和測(cè)序深度兩大特點(diǎn)而成為病毒宏基因組學(xué)研究的主要測(cè)序方法。近來(lái)Pacific Biosciences及Oxford Nanopore推出的三代測(cè)序技術(shù)，可以在數(shù)小時(shí)而不是幾天內(nèi)提供大量更長(zhǎng)讀長(zhǎng)的測(cè)序數(shù)據(jù)，使得病毒宏基因組學(xué)研究更加快速、結(jié)果更加可靠[30]。然而，測(cè)序高錯(cuò)誤率是這些高通量技術(shù)固有的缺點(diǎn)。在病毒宏基因組學(xué)分析中，通常使用BLASTx搜索分析樣品內(nèi)的病毒序列，下一代測(cè)序中的移碼突變會(huì)改變病毒基因組內(nèi)的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)，從而干擾蛋白質(zhì)相似性搜索，繼而影響高變異型病毒的鑒別。使用基于核苷酸序列相似性搜索(如BLASTn)時(shí)，移碼突變對(duì)鑒別已知病毒病原體的影響則較小。當(dāng)然，如果樣品內(nèi)病毒滴度比較高或下一代測(cè)序的深度較深，那么測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的突變則可以被序列拼接過(guò)程中的高覆蓋率所糾正。盡管下一代測(cè)序也可以用來(lái)檢測(cè)罕見(jiàn)的病毒變異(如HIV抗藥性突變體)，但在野生型病毒準(zhǔn)種鑒定方面卻需謹(jǐn)慎使用[31]。

2.3 病毒宏基因組學(xué)研究中的生物信息學(xué)分析

為了便于識(shí)別未知新型或高度變異型的病毒，下一代測(cè)序所產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)需要經(jīng)過(guò)從頭拼接，以將文庫(kù)內(nèi)所有DNA短序列組裝成更長(zhǎng)的重疊群。完成這一分析的軟件眾多，包括適用于Windows系統(tǒng)的CLC genomic workbench和Linux系統(tǒng)的ENSEMBLE assembler等[32]。序列拼接完成后，使用NCBI開(kāi)發(fā)的BLAST工具，在核酸或蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索重疊群和未組裝的單體序列。核苷酸相似性搜索(BLASTn)可以快速識(shí)別與已知病毒物種序列密切相關(guān)的序列。而與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知病毒核酸具有高度分歧度的病毒序列則無(wú)法使用核苷酸相似性搜索來(lái)識(shí)別，需要將它們的潛在翻譯產(chǎn)物與所有已知病毒蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行更嚴(yán)格的計(jì)算比較(BLASTx)，以檢測(cè)較弱的匹配。基于重疊群或者單體序列的BLASTx搜索結(jié)果可以直接導(dǎo)入其他軟件，獲得某個(gè)樣品內(nèi)病毒群落的組成。實(shí)現(xiàn)此類(lèi)分析的一個(gè)常用軟件為MEGAN 6.0，它不但可以顯示某個(gè)文庫(kù)內(nèi)的病毒群落組成，還可以根據(jù)序列數(shù)的多少給出樣品內(nèi)各類(lèi)病毒的相對(duì)含量信息，有利于判斷樣品病毒群落內(nèi)的優(yōu)勢(shì)病毒[33-35]。此外，該軟件還可以根據(jù)不同樣品的BLASTx搜索結(jié)果進(jìn)行橫向比較，從而分析一組樣品不同樣品間病毒群落及特定病毒的異同，確定一個(gè)研究群落內(nèi)的優(yōu)勢(shì)病毒類(lèi)型，有利于確定特定疾病與某種病毒感染的相關(guān)性。一般來(lái)說(shuō)，一旦潛在的新的病毒科、屬及種的全基因組序列被獲得，它的遺傳分類(lèi)地位及其與已知病毒科屬種之間的遺傳關(guān)系可以很快通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)確定[36]。在此過(guò)程中，需要檢索與待分析病毒相關(guān)的已知科屬種病毒的代表毒株的基因組或保守蛋白序列，經(jīng)過(guò)序列多重比對(duì)(multiple sequence alignment，MSA)，使用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件(如Mega 7.0及MrBayes等)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從而直觀表示新型病毒的遺傳分類(lèi)地位[37]。對(duì)來(lái)自任何特定宿主群體(如脊椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、原生動(dòng)物、植物和原核生物)的新病毒科的鑒定將有助于在其他宿主中檢測(cè)它們的同源病毒。

3 新發(fā)病毒與特定疾病的關(guān)聯(lián)分析

目前，部分常見(jiàn)病仍然沒(méi)有確切病原，包括部分急性胃腸炎、急性呼吸道感染、肝炎和腦炎等。此外，一些自身免疫性疾病和癌癥也可能是由仍未確定的病毒感染觸發(fā)。因此，病毒宏基因組學(xué)為識(shí)別此類(lèi)疾病的候選病原體提供了一種簡(jiǎn)單的工具。近年來(lái)，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)測(cè)定了大量人類(lèi)和動(dòng)物體內(nèi)的病毒群落[20]。雖然眾多未知新型病毒是在不明病因的患者臨床樣本中發(fā)現(xiàn)的，但它們?cè)谂R床樣本中的存在和發(fā)現(xiàn)可能是一種巧合，與這種特定疾病的發(fā)生沒(méi)有必然聯(lián)系，而只是反映了機(jī)體內(nèi)的無(wú)害感染[18,25]。一種鑒定出的新病毒可能真的是感染人類(lèi)的病毒，也可能只是簡(jiǎn)單地?cái)z入或吸入，然后一過(guò)性地通過(guò)腸道或支氣管腔而并不感染人體。研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)和動(dòng)物糞便中普遍檢測(cè)到攝入的植物、動(dòng)物和昆蟲(chóng)病毒核酸[37-38]。檢測(cè)到這類(lèi)核酸只是證明了它們?cè)谙乐芯哂写婊畹哪芰Α６祟?lèi)血清中特異性抗體的檢測(cè)可以用來(lái)證明病毒在人體內(nèi)的復(fù)制。不同于人類(lèi)腸道、呼吸道分泌物或皮膚樣品檢測(cè)到的病毒，血液、組織或腦脊液中檢測(cè)到的病毒更可能是病毒復(fù)制的證據(jù)。但病毒在人類(lèi)體內(nèi)的復(fù)制不能被認(rèn)為是病毒致病的確鑿證據(jù)，因?yàn)椴《究梢栽谝赘屑?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中繞過(guò)宿主限制，而且許多病毒可以在體外非宿主物種的細(xì)胞系中生長(zhǎng)。因此，研究新發(fā)病毒的感染與特定疾病的關(guān)聯(lián)分析就尤為重要，可以防止不必要的干預(yù)，如抗生素治療，并改進(jìn)治療措施和傳播預(yù)防。

對(duì)于新發(fā)病毒與特定疾病的關(guān)聯(lián)性研究，可以在病毒宏基因組學(xué)研究獲得病毒基因組序列的基礎(chǔ)上，使用(RT-)PCR法比較患者和健康對(duì)照樣本中的病毒攜帶率，也可以輔以定量PCR檢測(cè)方法比較疾病群體與健康對(duì)照群體體內(nèi)病毒載量。在病毒流行感染期間，病毒特異性抗體的檢測(cè)也是判斷特定疾病與該病毒感染相關(guān)性的重要依據(jù)。當(dāng)然，由于不同人群的病毒暴露和易感性可能有很大差異，因此疾病群體和對(duì)照樣本需要在流行病學(xué)上高度匹配，特別是年齡及地理來(lái)源。如不能將疾病群體與對(duì)照樣本正確匹配可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。疾病關(guān)聯(lián)研究最好也涉及來(lái)自不同地區(qū)或國(guó)家的不同年齡組。這種關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果可以高度提示新發(fā)病毒的致病作用。最終，要確切證明疾病與新發(fā)病毒感染之間的關(guān)聯(lián)，需要不同的研究小組使用不同的患者和對(duì)照樣本進(jìn)行確認(rèn)。使用特定的抗病毒藥物或接種病毒后，感染者恢復(fù)期血清特異性抗體的降低、癥狀的減輕、疾病患病率的降低是證明新發(fā)病毒致病性的直接方法。但這些措施只針對(duì)高致病性和流行的病毒感染。新發(fā)病毒致病性的最終確認(rèn)首先取決于如上所述的疾病關(guān)聯(lián)性試驗(yàn)。

4 病毒宏基因組學(xué)技術(shù)用于臨床快速診斷的展望

誠(chéng)然，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)目前還存在成本高、分析步驟煩瑣、分析周期長(zhǎng)等不足之處。一旦這些重要的障礙被突破(當(dāng)然這些缺陷相信會(huì)很快解決)，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)將是一個(gè)很具潛力的快速診斷臨床病毒感染的方法。同時(shí)，在生物制品的開(kāi)發(fā)和制造過(guò)程中，該技術(shù)也可以用來(lái)檢測(cè)病毒污染[39-40]。該方法要實(shí)現(xiàn)從科研到臨床快速診斷，縮短整體技術(shù)流程所需的時(shí)間是首先要解決的問(wèn)題，從臨床樣本采集到序列數(shù)據(jù)生成和生物信息學(xué)分析的時(shí)間縮短到具有臨床意義的1天乃至數(shù)小時(shí)，有利于臨床的早診斷、早治療，這將提高人們利用測(cè)序方法進(jìn)行臨床診斷的吸引力。成本問(wèn)題是另外一個(gè)急需解決的問(wèn)題，當(dāng)單一病毒檢測(cè)的成本相當(dāng)?shù)蜁r(shí)，則可以把病毒檢測(cè)作為醫(yī)療單位常規(guī)檢查之一。當(dāng)然，持續(xù)存在的DNA污染問(wèn)題和極低水平的病毒核酸檢測(cè)的醫(yī)學(xué)意義也需要解決。如果上述問(wèn)題能夠成功解決，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)有望成為單一全覆蓋式的病毒快速檢測(cè)方法，從而取代臨床許多病毒特異性測(cè)試。此外，在科研領(lǐng)域，新病毒的發(fā)現(xiàn)、病毒基因組的重新測(cè)序及病毒基因突變等方面，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)仍然會(huì)廣受歡迎。