血管緊張素轉換酶2在SARS-CoV-2感染中的作用機制研究進展

王薈，呂巧怡，趙楊靜，吳皓杰，邵啟祥

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇省檢驗醫學重點實驗室，江蘇 鎮江 212013)

1 SARS-CoV-2與COVID-19概述

2019年底一場不明原因的肺炎暴發于湖北武漢，隨后確認為新型冠狀病毒感染，該病毒最初被命名為2019-nCoV，2019年2月11日，國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將新型冠狀病毒(2019-nCoV)官方命名為重癥急性呼吸道綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，同一天世界衛生組織(WHO)將該病毒感染引起的疾病命名為2019冠狀病毒病(coronavirus disease 2019，COVID-19)。COVID-19雖然病死率低于SARS，但由于感染后潛伏期具有感染性而變得很難控制，導致感染人群基數很大。老年和伴有基礎疾病的患者感染后往往病情更嚴重，具有不良預后，嚴重威脅患者生活和健康[1]。

SARS-CoV-2屬于β-冠狀病毒屬，與2種蝙蝠冠狀病毒親緣性很近，目前猜測菊頭蝠可能是其自然宿主[2]。SARS-CoV-2利用其Spike蛋白(S蛋白)與宿主細胞血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)結合，從而進入細胞。SARS-CoV-2與SARS-CoV的差異較大，被認為是一種新型的人類感染性β冠狀病毒。SARS-CoV-2可通過呼吸道傳播進入鼻咽部，部分研究表明SARS-CoV-2也可能通過消化道、結膜等途徑進入機體[3]。COVID-19患者主要臨床癥狀為發熱、乏力、干咳等，住院期間可發展為肺炎、急性呼吸窘迫癥和休克[4]。然而研究發現除了肺部損傷外，突然加重的病情包括急性心肌損傷、心律不齊和急性腎損傷等并發癥[5]。因此，SARS-CoV-2 感染后損傷的不只是肺部，可能導致全身多個臟器損傷。SARS-CoV-2通過不同途徑傳播、損傷不同組織器官的特點與ACE2的表達情況、機體的免疫狀態有關。

2 SARS-CoV-2結合ACE2的結構解析

SARS-CoV-2主要利用其表面突觸蛋白S蛋白的受體結合結構域 (receptor binding domain,RBD) 結合ACE2。Yan等[6]率先采用冷凍電鏡技術成功解析了ACE2全長結構，發現ACE2以二聚體形式存在，無論開放或關閉狀態都包含一個共同識別SARS-CoV-2的表面。Lan等[7]利用X射線衍射技術準確定位了SARS-CoV-2的RBD與ACE2的結合位點。Wrapp等[8]利用冷凍電鏡成功解析了SARS-CoV-2的S蛋白三聚體結構，發現SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2的親和力是SARS-CoV的S蛋白和ACE2結合的10倍，從分子層面解析了SARS-CoV-2具有強感染性的原因。然而Walls等[9]發現SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白與人ACE2具有相同的結合能力，結構學研究發現SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白膜融合區域S2亞基高度保守。Shang等[10]發現與SARS-CoV的RBD相比，SARS-CoV-2中的RBD與ACE2結合可形成更緊湊的構象，其中部分氨基酸殘基的改變穩定了RBD-ACE2上的兩個病毒結合熱點，這些結構特征增強了與ACE2結合的親和力。部分遺傳學和結構學研究表明SARS-CoV-2的S蛋白被多種人體組織(包括肺、肝和小腸)中的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2活化，其他宿主蛋白酶如furin被認為對人畜共患病傳播至關重要，在氣道上皮細胞、心臟組織、腸道均有表達，可促進SARS-CoV-2進入宿主細胞[11]。

3 ACE2的組織表達與SARS-CoV-2感染

SARS-CoV-2和2003年爆發的SARS都通過ACE2感染機體[2]。單細胞測序結果發現ACE2表達在肺臟、心臟、腎臟、食管、膀胱、回腸、睪丸等不同器官，這些器官可能成為病毒攻擊的靶器官，而臨床報道也驗證了這一推測，因此SARS-CoV-2可能通過不同的途徑感染機體[12]。SARS-CoV-2可與支氣管上皮和人類Ⅱ型肺泡上皮細胞表面廣泛表達的ACE2結合，從而引起下呼吸道癥狀[13]。有報道發現近一半COVID-19患者以食欲缺乏、乏力、精神萎靡、惡心嘔吐和腹瀉等消化道癥狀為首發癥狀，這不僅可能與ACE2高表達于小腸近端和遠端上皮細胞有關，還與ACE2參與調節小腸炎癥和腹瀉有關[14]。近期發現有少數治療后“復陽”的患者也與腸道感染有關，病理結果發現盡管這些“康復患者”呼吸道檢測病毒為陰性，但胃腸道仍為陽性，且在腸道固有層中浸潤有大量的漿細胞、淋巴細胞，但多數患者腸道的損傷并不嚴重，僅表現為間質水腫。因此認為SARS-CoV-2可能破壞了腸道對微生物的屏障功能[15]。Chai等[16]利用生物信息學數據庫分析30余種惡性腫瘤遺傳和表觀遺傳學數據，發現ACE2在多種腫瘤組織中高表達，因此腫瘤患者可能對SARS-CoV-2更加易感。腫瘤患者ACE2高表達同時還伴有ACE2突變、拷貝數異常、啟動子區甲基化等異常，從而影響ACE2的生理功能。Cao等[17]發現東亞人群中ACE2 相關eQTL變異具有更高的等位基因頻率，這提示可能不同人群存在不同易感性。

4 ACE2參與免疫炎癥調節

除了作為病毒結合的受體，ACE2還參與調節免疫過程。在SARS-CoV感染的小鼠模型中發現S蛋白可下調ACE2的表達，并誘導ACE2胞外區脫落。人氣道上皮細胞分泌的金屬肽酶域17(metallopeptidase domain 17，ADAM17)和炎性細胞因子也可剪切膜表面的ACE2，使其脫落形成可溶性的ACE2，但引起普通感冒的冠狀病毒并不引起ACE2脫落[18]，因此推測可溶性的ACE2可能在COVID-19炎癥反應中發揮重要作用。但Monteil等[19]最近利用細胞、類器官培養研究卻發現重組可溶性ACE2可阻斷SARS-CoV-2的感染，這種重組的可溶性ACE2可通過在細胞外結合SARS-CoV-2發揮中和病毒作用從而阻斷感染。生物信息學分析發現肺癌組織中ACE2表達增高，存在miR-125b-5p-ACE2-IL6軸的調控作用，且miR-125b-5p促進ACE2表達，但抑制IL-6的表達，而SARS-CoV-2感染引起ACE2表達下調，可能會上調IL-6表達，引發細胞因子風暴，也稱為細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)，因此肺癌患者合并SARS-CoV-2感染，可能導致更為嚴重的細胞因子風暴和肺炎癥狀[20]。ACE2還廣泛表達于血管內皮細胞，這對調節血管張力和維持血管均質狀態是必不可少的。血管內皮細胞感染SARS-CoV-2后可招募免疫細胞并誘導自身凋亡，從而活化凝血系統，導致微循環功能障礙，進而引起心血管系統的缺血、出血、炎癥和功能障礙[21]。ACE2的表達下降也可引起腎素-血管緊張素系統紊亂，導致血管通透性增加，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是其中的關鍵效應物，過多的AngⅡ可通過ADAM17切割腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IL-6，產生可溶性IL-6，進一步加劇炎癥反應。值得一提的是，最近研究發現ACE2屬于人干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)，當機體感染SARS-CoV-2產生干擾素(interferon，IFN)抵抗病毒的同時，IFN-α上調ACE2的表達，促進更多的SARS-CoV-2侵入宿主細胞，這可能是某些患者快速進展的原因之一[22]。單細胞轉錄組測序分析發現ACE2在鼻分泌細胞和纖毛細胞中表達最高，因此鼻內給藥有可能限制病毒感染，同時ACE2共表達分析發現鼻黏膜還表達天然免疫相關基因，這些基因表達可能與降低病毒敏感性有關。而在Ⅱ型肺泡細胞中ACE2與多個病毒組裝復制相關的基因共表達，如小窩蛋白(caveolin)可促進病毒更易被吞噬[23]。不同組織ACE2表達和免疫特征聯合分析顯示，不同個體免疫反應具有差異性，男性可能具有更高的病死率[24]。此外，胸腺和骨髓是機體T細胞和B細胞的發育場所，研究表明胸腺和骨髓中也表達ACE2，可能成為病毒感染的靶器官[25]。

5 不同性別ACE2表達差異與疾病易感性和嚴重程度相關

許多研究觀察到COVID-19男性的發病率要顯著高于女性，同時重癥率和病死率也高于女性。研究表明吸煙會影響ACE2的表達，這也可能是男性患者更易感原因之一[26]。此外，共表達網絡分析發現，ACE2和雄激素受體表達呈正相關，染色質免疫共沉淀測序結果提示雄激素受體可能與ACE2上游的增強子區域結合；單細胞RNA測序結果顯示男性的前列腺和睪丸中ACE2普遍表達，是SARS-CoV-2感染的潛在靶器官[27]。以往研究發現中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus,MERS-CoV) 和SARS-CoV感染中男性患者數也高于女性[28]，推測可能與X染色體相關的基因和性激素的差異有關。同時研究表明SARS-CoV-2在進入宿主細胞時依賴宿主的Ⅱ型踦膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白[29]，該蛋白酶受雄激素調控。通過對男性和女性表達ACE2的細胞進行細胞因子差異表達分析后發現，促炎細胞因子特別是IL-6的受體在男性肺部多種細胞高表達，提示男性可能較女性更容易發生CRS[30]。

6 高齡和慢性并發癥患者ACE2變化與預后更差相關

高齡常作為SARS不良反應與死亡率預測的獨立危險因素，對于60歲或60歲以上的人群，SARS相關的死亡率可能超過50%[31]。高齡伴有并發癥也是與MERS-CoV感染、嚴重程度和死亡率相關的因素[32]。60歲以上老年人胸腺體積只有年輕人的1/10，幾乎不會產生初始T細胞，主要依靠外周免疫系統維持，因此對新發病毒感染的抵抗力較弱。不同組織ACE2表達和免疫特征聯合分析顯示，不同宿主免疫反應具有差異性，老年人可能具有更高的病死率[24]。代謝性炎癥會損害免疫系統，降低機體應對感染的能力，損害愈合過程，延長恢復時間。

臨床數據顯示高血壓、血管疾病患者感染SARS-CoV-2比例較大，而血管緊張素受體阻滯劑(ARB)沙坦類藥物和ACE抑制劑都能上調高血壓患者的ACE2表達，高脂肪和糖尿病也能上調ACE2表達[33]。因此具有慢性基礎疾病的患者ACE2表達增高可能導致其對SARS-CoV-2更加易感，但感染SARS-CoV-2后ACE2表達過低，可能破壞腎素-血管緊張素-醛固酮系統，導致多器官衰竭。

7 針對ACE2的靶向治療藥物、抗體和疫苗研究

SARS-CoV-2的S蛋白通過ACE2入侵細胞是感染機體的第一步，阻斷S蛋白和ACE2的結合可以有效阻止SARS-CoV-2的感染。針對ACE2化學藥物的臨床應用與新藥研發可能達到有效預防與治療的臨床效果。氯喹不僅具有抗瘧疾作用，還具備廣譜的抗病毒作用，其作用機制之一是氯喹可通過干擾宿主細胞ACE2末端糖基化從而影響S蛋白與ACE2的結合[34]。ACE抑制劑和他汀類降血壓藥物對非病毒性肺炎及無基礎疾病的患者具有臨床療效，而對COVID-19患者的臨床療效還有待充足的臨床試驗研究證明[35]。此外，重組ACE2蛋白被證明可有效阻止病毒入侵[19]。

Tian等[36]比對發現SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白的RBD相似度為73%，因此針對兩種病毒的抗體可能具有交叉反應，從SARS-CoV單克隆抗體庫中篩選可能治療SARS-CoV-2的中和抗體，通過比較多種SARS-CoV單克隆抗體與SARS-CoV-2 RBD結合的親和力，發現CR3022抗體具有較強結合SARS-CoV-2的能力，但并不能確定其具有中和活性。特異性中和抗體治療可以有效阻止病毒通過ACE2入侵，研究發現靶向SARS-CoV 的S蛋白的特異性中和抗體(m396、CR3014)雖然能阻斷其與ACE2的結合，但卻無法與SARS-CoV-2的S蛋白結合，這一結果提示SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白RBD的差異影響其與中和抗體的交叉結合反應，因此現有的SARS疫苗能否預防SARS-CoV-2感染尚不能確定。除了在SARS病毒抗體庫中篩選針對SARS-CoV-2的抗體外，還可從COVID-19康復患者體內分離分泌中和抗體的B細胞克隆，以篩選針對SARS-CoV-2的特異性單克隆抗體。Ju等[37]從COVID-19康復者外周血中篩選與SARS-CoV-2的RBD具有較強結合和中和能力，但與SARS和MERS病原體無交叉的抗體克隆，結果獲得206個B細胞克隆，通過測序獲得抗體編碼基因。Chen等[38]利用單個B細胞克隆的方法，從COVID-19患者分離出2個能分泌高中和活性抗體的B細胞克隆311mab-31B5和11mab-32D4，兩者的IC50分別為0.033 8和0.069 8 μg/mL。然而文獻表明非中和抗體可通過巨噬細胞的吞噬作用促進病毒在體內播散，或引起抗體依賴性增強作用(antibody-dependent enhancement，ADE)，或通過巨噬細胞表面的免疫球蛋白Fc受體進一步刺激炎癥細胞因子釋放，加劇CRS，而高親和力的單克隆抗體則不容易誘導ADE效應[39]。因此，從COVID-19患者體內獲取的高親和力單克隆抗體可能在治療和控制疫情方面發揮較大作用。恢復期血漿具有較好的耐受性[40]，可能通過中和病毒血癥改善臨床療效，與康復者血漿相比，單克隆抗體特異性高，也更容易生產和大規模制備，但篩選的單抗需要進一步臨床試驗進行有效性評估。

抗體治療主要通過中和病毒，阻止病毒入侵宿主細胞，還可介導免疫調理和抗體依賴性細胞介導的細胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytoto-xicity,ADCC) 作用以清除病毒，但這是一種被動免疫，持續時間很短，主要用于緊急預防和治療；而疫苗介導的是主動免疫，主要用于疾病預防。通過測序掌握SARS-CoV-2基因組，成功解析S蛋白及ACE2晶體結構對理解SARS-CoV-2如何入侵靶宿主細胞和疫苗設計提供了重要結構基礎。目前發現SARS-CoV-2的S蛋白較為保守，尚未發現產生變異，且其中的RBD在與ACE2結合過程中發揮決定性作用，因此SARS-CoV-2疫苗主要針對S蛋白或其RBD設計。除了重組蛋白疫苗外，目前同步開展研究的還有減毒活疫苗、牛痘苗嵌合疫苗、滅活病毒疫苗、亞單位疫苗、重組DNA和蛋白質疫苗的實驗研究和臨床試驗[41]。

8 結語

由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎大流行是一個全球性的衛生挑戰，ACE2是SARS-CoV-2進入宿主細胞并造成靶器官損傷的重要受體。本文主要闡述了ACE2參與的免疫炎癥過程的機制，分析了性別、年齡和基礎疾病等因素與ACE2表達差異及預后的聯系。通過對SARS-CoV-2結合ACE2的結構解析有助于研發阻斷病毒和受體有效結合的藥物靶點。目前不同類型疫苗和中和抗體的研究正在同步進行中，部分項目初期臨床數據較好，新冠疫苗和中和抗體有望成為抗疫主力應用于臨床預防和治療。