白細(xì)胞介素-17 A和白細(xì)胞介素-17 F在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)情況及與患者臨床特征的關(guān)系

閆美玲，張亞莉，張莉

商丘市第一人民醫(yī)院（徐州醫(yī)科大學(xué)商丘臨床學(xué)院）婦產(chǎn)科，河南 商丘 476100

卵巢上皮性癌是最常見(jiàn)的卵巢腫瘤，每年死亡人數(shù)約占全球惡性腫瘤死亡例數(shù)的5%，患者的5年生存率不到50%，早期癥狀不典型，患者就診時(shí)常發(fā)展至中晚期，腫瘤易轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除等治療后預(yù)后較差。因此，尋找可盡早發(fā)現(xiàn)卵巢上皮性癌的檢測(cè)指標(biāo)或方法以提高患者的生存率并改善預(yù)后具有重要的臨床意義。研究顯示，惡性腫瘤患者常伴有慢性持續(xù)性炎癥，炎性微環(huán)境可通過(guò)觸發(fā)基因突變、刺激微環(huán)境向免疫抑制微環(huán)境轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此炎癥因子可能是腫瘤檢測(cè)與治療的新靶點(diǎn)。白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）和白細(xì)胞介素-17F（interleukin-17F，IL-17F）均屬于白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）家族，由輔助性 T 細(xì)胞 17（T helper cell 17，Th17）表達(dá)，同源性高、染色體相似，在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤組織中均高度表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A和IL-17F對(duì)胃癌的發(fā)生與發(fā)展具有促進(jìn)作用，其表達(dá)與預(yù)后效果密切相關(guān)。本研究旨在探討IL-17A和IL-17F在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及與患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年10月商丘市第一人民醫(yī)院收治的卵巢上皮性癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為卵巢上皮性癌；②初診患者；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前曾接受過(guò)免疫治療或放化療；②合并其他部位腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入90例卵巢上皮性癌患者，其平均年齡為（56.14±7.86）歲，平均體重指數(shù)為（23.75±4.13）kg/m，合并糖尿病 6例（6.67%）、高血壓 10例（11.11%）、高血脂3例（3.33%）。選擇同期收治的23例交界性卵巢腫瘤患者和21例良性卵巢腫瘤患者。交界性卵巢腫瘤患者的平均年齡為（55.67±8.11）歲，平均體重指數(shù)為（23.84±4.36）kg/m，合并糖尿病3例（13.04%）、高血壓4例（17.39%）、高血脂1例（4.35%）。良性卵巢腫瘤患者的平均年齡為（56.65±8.24）歲，平均體重指數(shù)為（24.05±5.22）kg/m，合并糖尿病 2例（9.52%）、高血壓 3例（14.29%）、高血脂1例（4.76%）。3種類型卵巢疾病患者的年齡、體重指數(shù)及并發(fā)癥發(fā)生情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗人IL-17A單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔抗人IL-17F單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)LS-Bio公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二甲苯購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司，乙醇購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

①采用10%福爾馬林固定卵巢腫瘤組織標(biāo)本，取材后脫水至透明；②將石蠟包埋組織切為厚5 μm的切片，40℃溫水展開(kāi)后撈出，70℃烘干2 h；③將切片放入二甲苯中脫蠟2次，每次20 min；④依次加入100%乙醇（2次，每次4 min）、95%乙醇（2次，每次3 min）、90%乙醇（2次，每次2 min）、80%乙醇（2次，每次2 min）、70%乙醇（2次，每次2 min），蒸餾水沖洗脫蠟至水；⑤將切片與檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=6.0）一同放入修復(fù)盒中，置于高壓鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，時(shí)間為3 min；⑥加入3%HO，于室溫下避光靜置15 min，PBS浸洗3次，每次3 min；⑦滴加IL-17A一抗（1∶150）、IL-17F一抗（1∶100）各50 μl，室溫孵育1 h后于4℃放置過(guò)夜；⑧過(guò)夜后于37℃復(fù)溫30 min，PBS浸洗3次，每次3 min；⑨滴加IL-17A二抗（1∶150）、IL-17F二抗（1∶100）各50 μl，37 ℃孵育40 min，PBS浸洗3次，每次5 min；⑩加入DAB進(jìn)行顯色處理，顯微鏡下控制染色時(shí)間，完成后置于流動(dòng)蒸餾水中沖洗；?采用蘇木素復(fù)染3 min，流水沖洗20 min；?1%鹽酸乙醇分化10 s，氨水返藍(lán)30 s；?切片依次加入70%乙醇（3 min）、80%乙醇（3 min）、95%乙醇（3 min）、無(wú)水乙醇（5 min）脫水，加入二甲苯（2次，每次8 min）；?使用中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷

IL-17A和IL-17F陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒。隨機(jī)選擇5個(gè)染色均勻的區(qū)域，在200倍顯微鏡下觀察著色細(xì)胞占視野總細(xì)胞的百分比，取平均值。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，≤2分為陰性（-），3～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。陽(yáng)性表達(dá)率=（弱陽(yáng)性+中等陽(yáng)性+強(qiáng)陽(yáng)性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IL-17 A和IL-17 F表達(dá)情況的比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，IL-17A主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕褐色顆粒。IL-17F主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色顆粒。卵巢上皮性癌患者中IL-17A和IL-17F的陽(yáng)性表達(dá)率均高于交界性卵巢腫瘤患者和良性卵巢腫瘤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）（表1、表2）。

表1 不同類型卵巢疾病患者中IL-17 A的表達(dá)情況

表2 不同類型卵巢疾病患者中IL-17 F的表達(dá)情況

2.2 不同臨床特征卵巢上皮性癌患者中IL-17 A和IL-17 F表達(dá)情況的比較

不同年齡、腫瘤直徑、病理類型的卵巢上皮性癌患者中IL-17A和IL-17F的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/低分化的卵巢上皮性癌患者中IL-17A的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=5.205、8.725、5.198，

P

＜0.05）；FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/低分化的卵巢上皮性癌患者中IL-17F的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=6.024、10.697、6.328，

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征卵巢上皮性癌患者中IL-17 A和IL-17 F的表達(dá)情況（ n=90）

3 討論

卵巢上皮性癌常見(jiàn)于中老年女性，病死率居全部婦科腫瘤之首，早期腫瘤小且癥狀不明顯，腹部不能觸及，確診時(shí)多處于中晚期，導(dǎo)致治療及預(yù)后效果差。早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高婦科腫瘤患者預(yù)后最直接有效的方法。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。

IL-17A是由Th17細(xì)胞分泌的促炎因子，不僅可通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞上調(diào)抗菌肽的表達(dá)從而抵御炎癥和病菌，還可刺激其他免疫相關(guān)細(xì)胞大量分泌趨化因子、細(xì)胞因子，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、趨化單核細(xì)胞等游走至炎癥部位，發(fā)揮獲得性免疫和天然免疫雙重作用。然而IL-17A在腫瘤微環(huán)境中的作用截然相反，表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤免疫抑制。IL-17F最初稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原8（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 8，CTLA8），因與IL-17A的同源性最高，遂加入IL-17家族，二者作用相近，IL-17F也可誘導(dǎo)各種免疫相關(guān)細(xì)胞分泌炎性因子、趨化因子，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞游走，從而抑制腫瘤。二者也各具獨(dú)特功能，IL-17F可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-B1（transforming growth factor-B1，TGF-B1）的表達(dá)，下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、IL-6、IL-8的表達(dá)，抑制新生血管形成，發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，IL-17F會(huì)刺激腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）1、MMP3、MMP13等，導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

IL-17家族在臨床診斷和評(píng)估機(jī)體炎癥、腫瘤中的作用越來(lái)越受到重視。張曉欲等研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-17聯(lián)合糖類抗原125、微小RNA（microRNA，miRNA）-200a可用于早期診斷上皮性卵巢癌，并可通過(guò)其水平變化評(píng)估腫瘤進(jìn)展情況。但是血清中IL-17A和IL-17F的來(lái)源廣泛，無(wú)法準(zhǔn)確反映腫瘤局部浸潤(rùn)水平，因此通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)因子的表達(dá)可更真實(shí)準(zhǔn)確地反映腫瘤的浸潤(rùn)水平，對(duì)于探究局部腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)更具意義。本研究通過(guò)對(duì)卵巢疾病患者的腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮性癌患者中IL-17A和IL-17F的陽(yáng)性表達(dá)率均高于交界性卵巢腫瘤患者和良性卵巢腫瘤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。這與胃癌組織中IL-17A和IL-17F表達(dá)水平較高的結(jié)果具有相似性。此外，本研究結(jié)果還顯示，不同年齡、腫瘤直徑、病理類型的卵巢上皮性癌患者中IL-17A和IL-17F的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/低分化的卵巢上皮性癌患者中IL-17A和IL-17F的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。

綜上所述，卵巢上皮性癌患者中IL-17A和IL-17F的陽(yáng)性表達(dá)率較高，IL-17A和IL-17F表達(dá)情況與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及組織分化程度密切相關(guān)，提示IL-17A和IL-17F可能作為卵巢上皮性癌的診斷指標(biāo)和潛在治療靶點(diǎn)。