Fc γRIIA基因多態性與急性白血病患兒化療后并發感染的關系

劉珍，郭青，朱瑩瑩，蘇淑芳，孫曉敏#

鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院/鄭州兒童醫院1普內科，2血液腫瘤科，鄭州 450000

3鄭州大學第一附屬醫院小兒血液腫瘤科，鄭州 450000

急性白血病是造血干細胞發生克隆性病變，造成幼稚細胞和原始細胞大量增殖，進而抑制了生理造血功能所致。急性白血病患者的主要臨床表現是貧血、感染和臟器浸潤等。急性白血病在兒童中的發病率較高，臨床治療以化療為主。研究顯示，化療可明顯緩解病情，改善預后，但化療易造成中性粒細胞缺乏，導致患者機體免疫功能下降，并發感染。中性粒細胞對于機體抵御病原微生物感染具有重要意義。FcγRIIA是中性粒細胞表面的FC受體，能夠與免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）結合，對吞噬作用進行調節。本研究分析了

FcγRIIA

基因多態性與白血病患兒化療并發感染的關系，旨在為有效預防白血病化療后并發感染提供指導，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年6月至2018年6月鄭州大學附屬兒童醫院收治的急性白血病患兒的臨床資料，所有患兒均經細胞形態學、免疫分型、細胞遺傳學和分子生物學檢查確診，診斷標準符合第3版《血液病診斷及療效標準》。納入標準：適用于世界衛生組織（WHO）制定的造血、淋巴細胞腫瘤疾病相關判定標準；借助病理學、形態學、免疫學等技術確診為急性白血病。排除標準：存在精神障礙，溝通能力較弱；臨床資料不完整；合并免疫系統疾病。根據納入和排除標準，本研究共納入49例急性白血病患兒，其中，急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患兒19例，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患兒30例；男29例，女20例；年齡5～15歲，平均（10.3±5.6）歲；初治患兒38例（ALL 16例，AML 22例），鞏固性化療患兒7例（ALL 3例，AML 4例），難治復發（均為AML）患兒4例。所有患兒均于化療結束后進行細菌感染分析。根據化療后是否感染將49例急性白血病患兒分為感染組（

n

=28）和未感染組（

n

=21）。感染組中，男16例，女12例；平均年齡為（10.0±6.0）歲；疾病類型：ALL 10例，AML 18例。未感染組中，男11例，女10例；平均年齡為（10.8±5.4）歲；疾病類型：ALL 9例，AML 12例。兩組患兒的年齡、性別、疾病類型比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑及材料

紅細胞裂解液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq DNA聚合酶mix和T載體試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的Ly-6G（Gr-1）流式抗體購自eBioscience公司；BD流式細胞儀購自美國BD公司；其他有機試劑均購自國藥集團。

1.3 標本采集及處理

采集兩組患者清晨空腹靜脈血5 ml，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）3倍稀釋血樣，加入紅細胞裂解液，裂解紅細胞，收集白細胞，采用PBS洗滌3次并重懸，細胞密度調整為1×10/ml，每毫升細胞中加入FITC標記的Ly-6G（Gr-1）流式抗體1 μg，室溫避光孵育30 min，然后采用PBS洗滌3次，應用流式細胞儀分選中性粒細胞。

1.4 化療后感染評定標準

急性白血病患兒化療后出現感染的評定標準：體溫高于38℃，時間超過2 h；呼吸道、口腔、胃腸道出現感染癥狀。

1.5 Fc γRIIA基因多態性分析

采用基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA，根據

FcγRIIA

基因序列設計引物序列。

FcγRIIA

-F： 5'-ATCCCAGAAATCCTCCCA-3'；

FcγRIIA

-R：5'-ATCCCIAGAAATTCTCCCG-3'；

FcγRIIA

-Rev：5'-CAATTTTGCTGCTATGGGC-3'。以人生長激素基因作為內標。

Control

-F：5'-CAGTGCCTTCCCAACCATTCCTTA-3'。

Control

-R：5'-ATCCACTCACGGATTTCTGTTGTGTGTTTC-3'。PCR反應體系：2×Taq DNA聚合酶25 μl，

FcγRIIA

-F 1 μl，

FcγRIIA

-R 1 μl，

FcγRIIA

-Rev 1 μl，cDNA 1 μl，加水補至50 μl。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環，最后降溫至4℃。將部分PCR產物按照T載體使用手冊連接進入T載體，轉化大腸桿菌DH5a，將轉化后的大腸桿菌涂布于固體LB平板上，置于37℃培養過夜，次日待菌落生長后，挑取單克隆菌落進行測序分析。

1.6 基因多態性與化療后感染的關系分析

分析不同

FcγRIIA

基因型患兒化療后骨髓抑制的感染情況以及基因多態性與化療后并發感染的關系。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 Fc γRIIA基因多態性情況

測序結果顯示，

FcγRIIA

基因存在基因多態性。

FcγRIIA

基因第二個外顯子編碼FcγRIIA蛋白131位氨基酸的基因位點存在多態性，堿基分別為A或G。等位A堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白131位氨基酸為組氨酸H，命名為FcγRIIA-H型；等位G堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白131位氨基酸為精氨酸R，命名為FcγRIIA-R型；等位A/G堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白131位氨基酸包括精氨酸R和組氨酸H，命名為FcγRIIA-R/H型。49例急性白血病患兒中，6例患兒為FcγRIIA-R/H型，17例患兒為FcγRIIA-H型，26例患兒為FcγRIIA-R型。（圖1）

圖1 Fc γRIIA基因多態性分析

2.2 基因型分布情況與急性白血病患兒化療后感染的關系

未感染組FcγRIIA-H型的表達頻率明顯高于感染組，FcγRIIA-R型的表達頻率明顯低于感染組，差異均有統計學意義（

χ

=12.010、8.849，

P

＜0.01）。（表1）

表1 兩組患兒基因型表達情況的比較[ n（%）]

3 討論

感染是急性白血病化療后的常見并發癥，嚴重影響白血病化療患兒的預后。化療后，白血病患兒的中性粒細胞水平明顯下降。中性粒細胞在抵御細菌感染中具有重要作用，除了其數量的變化外，基因型等內在因素是否是化療后感染的易感因素值得深入探討。

中性粒細胞表面存在許多受體，其中，Fc受體在免疫復合物的吞噬中起著關鍵作用。FcγRIIA是Fc受體家族成員，部分研究發現

FcγRIIA

基因存在多態性，與胃癌、慢性牙周炎和系統紅斑性狼瘡等疾病具有密切關聯。但是，目前，關于

FcγRIIA

基因多態性與感染關系的研究報道極少。本研究分析了

FcγRIIA

基因多態性與白血病患兒化療后并發感染的關系，提取了患兒中性粒細胞基因組，通過分子生物學技術分析發現

FcγRIIA

基因第二個外顯子編碼FcγRIIA蛋白131位氨基酸的基因位點存在多態性，堿基分別為A或G。等位A堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白131位氨基酸為組氨酸H；等位G堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白質131位氨基酸為精氨酸R；等位A/G堿基使

FcγRIIA

基因編碼的蛋白質131位氨基酸包括精氨酸R和組氨酸H。本研究進一步對感染者和未感染者的基因型進行分析，發現未感染組FcγRIIA-H型的表達頻率明顯高于感染組，而FcγRIIA-R型的表達頻率明顯低于感染組。說明白血病患兒化療并發感染與患兒的

FcγRIIA

基因多態性密切相關。從分子機制而言，

FcγRIIA

基因多態性導致編碼蛋白質的氨基酸存在差異，使編碼蛋白質與IgG的結合能力發生變化，而IgG的結合能力在抵抗病原微生物感染中發揮著重要作用。若

FcγRIIA

基因編碼蛋白質131位氨基酸為組氨酸H，則增強了FcγRIIA蛋白與IgG的結合能力，從而增強了其對病原微生物的殺傷能力，減少了感染的可能性。反之，若

FcγRIIA

基因編碼蛋白質131位氨基酸為精氨酸R，則與IgG的親和力減弱，增加了感染的可能性。綜上所述，

FcγRIIA

基因多態性是造成白血病患兒骨髓抑制期出現感染的原因之一，本研究有望為白血病患兒骨髓抑制期感染提供一定的預防依據。但是，本研究納入的白血病患兒病例數較少，需要多中心、前瞻性的研究進一步分析、討論。