張勇，張煒，范崇盛

鄭州大學附屬洛陽中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科，河南 洛陽 471000

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，盡管手術對喉癌的療效已被證實，但術后復發仍是臨床面臨的棘手問題。雖然尋找預測喉癌患者預后的指標非常重要，但尚未發現可以預測喉癌患者術后復發情況的特異性標志物。p21可以減少受損的DNA復制，防止異常細胞增殖，從而抑制惡性腫瘤的發生與發展。研究表明，p21可能是抑癌基因，但在某些條件下，其可以促進細胞增殖，并具有致癌性，其表達主要取決于細胞環境。Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）參與了多種器官的生長和細胞的增殖過程，在維持機體內環境穩態方面發揮著重要作用，被認為與多種腫瘤的發生、發展有關。關于腫瘤組織中p21表達情況的研究已有報道，但關于p21和YAP同時表達情況的研究報道很少。本研究初步探討喉癌組織中p21、YAP蛋白的表達情況與喉癌患者術后復發情況的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月至2017年4月鄭州大學附屬洛陽中心醫院行手術治療的喉癌患者。納入標準：①符合2014年版《喉癌外科手術及綜合治療專家共識》中關于喉癌的診斷標準；②術前經喉鏡、CT、MRI檢查確診，術后經病理學檢查證實；③術前未接受放化療、免疫學治療；④年齡為19～79歲：⑤臨床資料完整。排除標準：①轉移性喉癌；②有放化療史；③長期使用免疫抑制劑。根據納入和排除標準，本研究共納入118例喉癌患者，根據復發情況分為復發組（

n

=47）、非復發組（

n

=68）和失訪患者3例。復發組中，男41例，女6例；年齡51～79歲，平均（64.8±6.2）歲。非復發組中，男57例，女11例；年齡44～79歲，平均（63.3±7.8）歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化染色法

切除整塊腫瘤后，留取喉癌病灶組織，將所取標本置于4%中性甲醛中固定，常規制作組織石蠟切片，并進行常規免疫組化處理，滴加一抗4℃孵育過夜，一抗的工作濃度為1∶100，孵育后，第2天采用磷酸鹽緩沖液洗滌切片，清洗3次，每次10 min，然后滴加二抗進行孵育1 h，再依次進行SABC孵育、二氨基聯苯胺顯色等，最后使用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。選擇YAP和p21表達陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。觀察細胞的陽性表達情況。兩種蛋白的一抗、二抗均購自美國Invitrogen公司。

1.3 免疫組化染色結果判定

p21、YAP蛋白陽性表達于細胞核或細胞質和細胞膜，陽性染色呈黃色、棕黃色、褐色。依據染色強度評分：未染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，褐色、黑色計3分。依據陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞所占百分比≤10%，計1分；陽性細胞所占百分比為11%～50%，計2分；陽性細胞所占百分比為51%～75%，計3分；陽性細胞所占百分比＞75%，計4分。染色程度與陽性細胞所占百分比評分相乘，總分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 p21、YAP蛋白在喉癌組織中陽性表達情況的比較

復發組患者喉癌組織中p21蛋白的陽性表達率為23.40%（11/47），明顯低于非復發組患者的51.47%（35/68），差異有統計學意義（

χ

=9.122，

P

＜0.01）；復發組患者喉癌組織中YAP蛋白的的陽性表達率為80.85%（38/47），明顯高于非復發組患者的57.35%（39/68），差異有統計學意義（

χ

=6.936，

P

＜0.01）。

2.2 喉癌患者術后復發情況的單因素分析

兩組患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、病灶部位、術后化療情況比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）；復發組TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結轉移的患者比例均高于非復發組，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表1）

表1 115例喉癌患者術后復發情況影響因素的單因素分析*

2.3 喉癌患者術后復發情況影響因素的多因素分析

以TNM分期、組織分化程度、淋巴結轉移情況、p21蛋白表達情況、YAP蛋白表達情況作為自變量，以術后3年復發情況作為因變量，納入Logistic回歸分析模型進行多因素分析，結果顯示，TNM分期高、發生淋巴結轉移、YAP蛋白陽性表達均是喉癌患者術后復發的獨立危險因素，p21蛋白陽性表達率升高是喉癌患者術后復發的獨立保護因素（

P

＜0.05）。（表2）

表2 115例喉癌患者術后復發情況影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

喉癌是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，由于一系列原因，其發病率不斷升高，臨床治療方法亦不斷改進，同時，患者的術后復發情況受到廣泛重視，但關于喉癌患者術后檢測的特異性指標臨床尚存在爭議。

Hippo信號通路的作用體現在維持機體生理功能穩態的各個方面，在腫瘤的發生、發展過程中亦發揮了關鍵性作用。YAP蛋白是Hippo信號通路中的主要效應因子，位于人染色體11q22。有研究發現，YAP蛋白在許多腫瘤中均異常高表達，并能預示腫瘤的轉移及預后情況。本研究發現，復發組患者喉癌組織中YAP蛋白的的陽性表達率明顯高于非復發組（

P

＜0.01），另外，TNM分期高、發生淋巴結轉移、YAP蛋白陽性表達均是喉癌患者術后復發的獨立危險因素（

P

＜0.05）。原因是YAP蛋白在喉癌中的表達可能具有積極的調節作用。WNT信號轉導通路在腫瘤的進程中發揮著重要作用，當其他因素作用于WNT信號轉導通路時，WNT信號轉導通路被激活，WNT信號轉導通路中B-catenin的降解過程受到抑制，細胞中B-catenin水平很高，其進入細胞核后，激活下游靶基因，促進腫瘤的轉移與發展。有研究發現，WNT與Hippo信號通路具有協同作用。因此，推測Hippo和WNT信號通路通過YAP和B-catenin的協同作用，促進了喉癌細胞的增殖，使喉癌細胞于術后易于發生轉移，增加了術后復發風險，但由于本研究的樣本數量有限，仍需加大樣本量進一步探討。p21蛋白是一種可調控細胞周期的抑制蛋白，對DNA的損傷修復具有一定影響。p21還能抑制CDK復合物的活性，從而導致細胞停滯于G期，具有調節細胞周期的作用。p21阻滯了各種應激環境下的細胞周期，并在腫瘤抑制信號通路中發揮抗增殖效應，從而抑制細胞增殖。然而，在某些條件下，p21可以促進細胞增殖和致癌性，其表達情況主要取決于細胞環境。本研究發現，復發組患者喉癌組織中p21蛋白的陽性表達率明顯低于非復發組（

P

＜0.01）；p21蛋白陽性表達率升高是喉癌患者術后復發的保護性因素（

P

＜0.05）。分析其原因是p53的激活可導致下游產物p21的過表達，從而通過滅活CDK2阻止了細胞周期的進程。p21分子具有與p53的結合區，惡性腫瘤組織中p53突變體的表達可刺激p21的異常表達，導致腫瘤細胞惡化。研究發現，腫瘤中p21的表達存在細胞異質性，p21蛋白的穩定性良好，易出現蛋白積累。p21的C端和N端可以與某些部分相互作用，其水平隨著細胞增殖周期的變化而變化，可反映細胞的增殖狀態。p21過表達表明細胞已在分子水平發生了改變，這種改變通常先表現于細胞形態，這可能是患者術后復發的原因之一，并且是預后預測的關鍵生物學指標。

綜上所述，喉癌組織中p21蛋白表達水平的降低、YAP蛋白表達水平的升高可能會增加喉癌患者術后復發的風險。另外，TNM分期高、發生淋巴結轉移、YAP蛋白陽性表達均是喉癌患者術后復發的獨立危險因素，p21蛋白陽性表達率升高是喉癌患者術后復發的獨立保護因素。p21和YAP蛋白的表達情況可為喉癌的預后預測提供參考，并認為其分子結構水平的異常表達可用于疾病的預后判斷。本研究的不足之處在于未對陽性指標進行跟進，在今后的研究中需要對陽性表達的患者采取有效的預測性對癥干預措施。