胃癌中異位病毒整合位點- 1的表達及臨床意義

黃燕美,秦攀,張鳳,王海燕,陳淑勤#

福建醫科大學1基礎醫學院病理學系，2腫瘤研究室，3病理診斷中心，福州 350004

異位病毒整合位點-1（ecotropic viral integration site-1，EVI-1）最早是在1988年被確定為小鼠髓系腫瘤中逆轉錄病毒整合的常見位點。人類的

EVI-1

基因位于染色體3q26.2上，參與包括細胞周期、增殖、分化等在內的許多信號通路的調控。它編碼的產物是帶有鋅指結構的轉錄因子，由于多種剪切形式的存在，該基因編碼多個剪切變異體蛋白，主要亞型有MDS1/EVI-1、EVI-1和EVI-1△324。3種蛋白的結構簡圖如圖1所示，主要亞型EVI-1蛋白N末端有7個鋅指結構，參與對靶基因啟動子保守序列GATA基序的識別，C末端有3個鋅指結構，結合ETS樣基序。與EVI-1蛋白相比，EVI-1△324蛋白N端缺少6、7兩個鋅指結構，破壞了結合GATA樣基序的功能，但有與EVI-1蛋白共同的C端鋅指結構域。EVI-1△324與EVI-1的靶基因有70.7%的相似性，二者具有相似的轉錄調節功能。MDS1/EVI-1較EVI-1多了一個叫“PR”的區域。研究表明，MDS1/EVI-1與腫瘤抑制活性相關，而EVI-1在造血來源的腫瘤和一些實體腫瘤如結腸癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中引發了腫瘤蛋白的效應，它在這些腫瘤中不僅過表達，并且也參與這些腫瘤的發生和進展，EVI-1△324表達也引發了類似的效應。但

EVI-1

基因在胃癌中有怎樣的表達模式，是否可作為潛在的治療靶點，迄今為止研究甚少。

圖1 EVI- 1基因編碼的剪切變異體蛋白結構簡圖

鑒于此，本研究擬采用免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）法檢測胃癌組織和癌旁正常組織中EVI-1蛋白的表達情況，采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測不同人胃癌細胞株和人永生化正常胃黏膜上皮細胞中MDS1/EVI-1、EVI-1和EVI-1△324 3種剪切變異體蛋白的表達，采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測不同人胃癌細胞株和人永生化正常胃黏膜上皮細胞中

EVI-1

mRNA的表達情況，探討

EVI-1

基因在胃癌中的作用，為評價其作為胃癌診療指標的可行性提供前期實驗基礎和理論依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2009年4月至2015年7月被診斷為胃癌的60例患者。納入標準：①經病理學檢查確診為胃癌；②術前均未行化療、放療以及其他治療，亦未有遠處轉移。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②具有腫瘤家族史。60例胃癌患者中，男44例，女16例。本研究通過福建醫科大學倫理審查委員會的批準。

1.2 組織標本收集和保存

胃癌組織和相應癌旁正常胃組織（距腫瘤組織＞4 cm）取自胃癌患者手術后的標本，采用中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋。所有石蠟包埋組織切成4～5 μm附于經防脫片處理的載玻片上，置于56℃烤箱烘烤過夜以備次日行IHC實驗。

1.3 試劑

即用型ELIVISIONtm PLUS試劑盒（鼠/兔）購自福州邁新公司；EVI-1兔單克隆抗體購自美國Sigma公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自中國Beyotime公司；逆轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit、qPCR檢測試劑盒均購自日本TaKaRa公司。EVI-1引物由上海博尚生物技術有限公司合成。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞株與培養條件人高分化胃腺癌細胞AGS、中分化胃腺癌細胞NCI-N87均購自中國科學院細胞庫；人胃黏液腺癌細胞MGC-803和永生化正常胃黏膜上皮細胞GES-1均購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫；人未分化胃癌細胞HGC27由福建醫科大學轉化醫學院盧坤平教授課題組惠贈。GES-1、AGS細胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養液常規培養，NCI-N87、MGC-803及HGC27細胞用含10% FBS、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養液常規培養。細胞傳代用0.25%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化，并采用細胞凍存用凍存液（完全培養基∶FBS∶DMSO=7∶2∶1）進行凍存。

1.4.2 IHC法檢測胃癌組織及癌旁組織中EVI- 1蛋白的表達二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高壓修復抗原。EVI-1抗體（1∶200稀釋）37℃孵育1 h。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，二抗37℃孵育30 min。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色后蒸餾水沖洗，蘇木素復染、鹽酸分化、流水返藍，最后中性樹脂封片。IHC評分以著色強度及陽性細胞百分比綜合評分。著色強度：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞百分比：≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩項得分相加為總得分，≤2分為陰性，＞2分為陽性。染色結果由兩位病理醫師采用雙盲法獨立觀察判定。

1.4.3 蛋白質提取與Western blot檢測取對數生長期細胞，PBS洗2遍。刮下細胞，加入現配的強裂解液RIPA與PMSF（RIPA∶PMSF=100∶1），冰上裂解30 min。4℃，12 000 r/min離心20 min。將上清液移至新的EP管。向剩余上清液中加入相應的5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），于沸水中煮沸10 min。利用8% SDSPAGE凝膠進行凝膠電泳，分離后轉移至PVDF膜，8%脫脂奶粉封閉3 h，分別用EVI-1抗體（1∶1000稀釋）、B-actin抗體（1∶4000稀釋）4 ℃孵育過夜，1×TBST液洗10 min×3次后，用相應的二抗孵育1 h，1×TBST液洗10 min×3次，最后用凝膠成像系統成像觀察，以Image-Pro Plus軟件量化結果。蛋白相對表達量用目的蛋白灰度值/B-actin灰度值表示。

1.4.4 mRNA提取及逆轉錄取對數生長期細胞，PBS漂洗后加入1 ml Trizol裂解液，冰上裂解5 min，移至經RNAase滅活處理的EP管中，冰上裂解5 min。加0.2 ml氯仿，冰上靜置5 min后，4℃、12 000 r/min離心15 min。將上層透明水相轉入新的1.5 ml EP管中，加入等體積的異丙醇，冰上靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。棄凈上清，加1 ml預冷的75%乙醇，4℃、7500 r/min離心10 min。棄上清，室溫干燥20～30 min，加10～20 μl的DEPC水溶解。分光光度計檢測RNA濃度及純度。計算濃度，將提取的RNA稀釋為500 ng/μl，根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA。

1.4.5 qRT-PCR檢測設計引物，

EVI-1

上游引物為 5'-CCACGAAGAACGGCAATATC-3'，下游引物為 5'-GGTCACATTCCTTACACTCCT-3'；

B-actin

上游引物為 5'-GCGTGACATTAAGGAGAAGC-3'，下游引物為5'-CCACGTCACACTTCATGATGG-3'。根據說明書，用經改良的耐熱性DNA聚合酶TaKa-Ra Ex Taq，將經逆轉錄后的mRNA于Mx3000P PCR儀上進行PCR擴增，監控PCR產物的擴增量。預變性：95 ℃ 30 s，擴增：95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40個循環，溶解曲線程序：95℃15 s、60℃60 s、95℃15 s。mRNA相對表達量以GES-1細胞為對照組，結果用 2值表示。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 胃癌組織和癌旁正常胃組織中EVI- 1蛋白表達情況的比較

IHC法檢測EVI-1蛋白的表達情況，EVI-1蛋白表達于胃癌細胞及癌旁正常胃黏膜腺上皮細胞的細胞核中，間質未見表達（圖2）。胃癌組織中EVI-1蛋白的陽性表達率為76.7%（46/60），明顯高于癌旁正常胃組織的41.7%（25/60），差異有統計學意義（

χ

=15.211，

P

=0.000）。

圖2 胃癌組織和癌旁正常胃組織中EVI- 1蛋白的表達情況（IHC）

2.2 3種剪切變異體蛋白在不同細胞株中表達情況的比較

Western blot檢測MDS1/EVI-1、EVI-1及EVI-1△324 3種剪切變異體蛋白在胃癌細胞株AGS、NCI-N87、MGC-803、HGC27及永生化正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中的表達。結果顯示，各胃癌細胞中MDS1/EVI-1和EVI-1蛋白相對表達量均高于正常胃黏膜上皮細胞，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；MGC-803、AGS胃癌細胞中EVI-1△324蛋白相對表達量也均高于正常胃黏膜上皮細胞，但差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（圖3、表1）

圖3 Western blot法檢測MDS 1/EVI- 1、EVI- 1及EVI- 1△324蛋白在各細胞株中的表達

表1 各細胞株中MDS 1/EVI- 1、EVI- 1及EVI- 1△324相對表達量的比較（±s）

2.3 人胃癌細胞株和正常胃黏膜上皮細胞株中EVI- 1 mRNA相對表達量的比較

qRT-PCR法檢測胃癌細胞株AGS、NCI-N87、HGC27及永生化正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中的

EVI-1

mRNA相對表達量。HGC27、NCI-N87、AGS細胞株中

EVI-1

mRNA相對表達量分別為（5.750±0.864）、（52.753±14.205）、（51.536±12.397），均明顯高于GES-1細胞株，差異均有統計學意義（

t

=7.778、5.153、5.765，

P

＜0.01）。

3 討論

本研究結果顯示，胃癌組織中EVI-1蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁正常胃組織。3個剪切變異體蛋白除EVI-1△324外，MDS1/EVI-1和EVI-1在4株不同分化的胃癌細胞中的相對表達量均高于永生化正常胃黏膜細胞，

EVI-1

mRNA在3株不同分化的胃癌細胞中的相對表達量也均高于永生化正常胃黏膜細胞，提示

EVI-1

可能是潛在的胃癌原癌基因。迄今為止，EVI-1在胃癌中的研究甚少。丁向萍等報道，胃癌組織中

EVI-1

mRNA表達較萎縮性胃炎和正常對照組增高，有淋巴結轉移組

EVI-1

mRNA表達較無淋巴結轉移組也有明顯增高，但

EVI-1

mRNA表達與腫瘤組織的分化程度無關。這與本研究結果有一致之處，本研究也顯示，在4株不同分化的胃癌細胞中，無論是EVI-1蛋白還是mRNA的表達，均無差異。EVI-1在胃癌的發生發展中起了怎樣的作用，其中蘊含著怎樣的機制，尚未知曉。研究表明，

EVI-1

基因在人類惡性髓系腫瘤如急性粒細胞白血病（acute myeloblastic leukemia，AML）和多種實體腫瘤如胰腺癌、前列腺癌、肝內膽管癌、腎透明細胞癌、腦多形性膠質瘤等中均有過度擴增或過度活化，從而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲，抑制腫瘤細胞的凋亡，削弱對化療藥物的敏感性，與患者的不良預后密切相關。EVI-1促進不同腫瘤發生發展的作用機制：①EVI-1通過表觀遺傳調控影響抑癌基因張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的轉錄，抑制PTEN的表達，從而激活磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）-雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路，促進腫瘤生長。PTEN具有磷酸酶活性，其正常表達能夠抑制腫瘤細胞的生長、遷移和浸潤，高表達

EVI-1

基因的AML患者有極差的預后，因此可將EVI-1作為治療靶點抑制PI3K-AKTMTOR信號通路，對抗其不良預后。②

EVI-1

基因可以激活基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）成員如基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）等，降解基底膜及腫瘤細胞外間質，促進腫瘤的侵襲和轉移。③EVI-1與miRNA彼此之間存在交互作用，如miRNA-206和miRNA-1可下調EVI-1的表達，從而下調乳腺癌干細胞的增殖能力；胰腺癌細胞中EVI-1在轉錄水平下調miRNA-56，從而解除對Kristen鼠肉瘤致癌基因（KRAS proto-oncogene，KRAS）的抑制，激活KRAS通路。④EVI-1能夠特異性結合并抑制SMAD家 庭 成員3（SMAD family member 3，SMAD3），從而抑制由轉化生長因子-B（transforming growth factor-B，TGF-B）誘導的抗細胞增殖作用。⑤EVI-1與Snail家族轉錄抑制因子2（Snail family transcriptional repressor 2，SLUG）呈負相關，調節上皮-間充質轉化，從而影響結腸癌的形成和遠處轉移能力。EVI-1在胃癌中是否也涉及上述類似的機制，尚未清楚。需要說明的是，本研究因樣本量有限，尚未根據臨床特征如腫瘤體積大小、浸潤深度、組織分化等進行分層分析；此外，由于轉錄水平和蛋白一樣也存在多種剪切形式，本研究采用

EVI-1

基因的通用引物，因此能夠擴增絕大多數

EVI-1

mRNA的剪切體，檢測到的mRNA相對表達量能夠最大限度地接近真實水平。綜上所述，本研究對胃癌組織和細胞中EVI-1的轉錄和翻譯水平進行了初步探討，顯示EVI-1在胃癌中表達升高，說明

EVI-1

基因可能在胃癌中也扮演了與在其他腫瘤中類似的原癌基因的角色，但具體的作用機制尚不清楚，有待后續的體內、體外功能學實驗進行深入探討。本研究為后續研究EVI-1作為胃癌治療靶點的可能性打下了理論基礎和實驗依據。