節律基因在乳腺癌中表達變化的研究

張明暉，趙妍，孫雅麗，魏海波，楊春潔

赤峰市醫院腫瘤內三科，內蒙古 赤峰 024000

晝夜節律是由一組基因節律性表達形成的24 h周期振蕩的自主調節轉錄-翻譯反饋回路。Michael Rosbash等因發現調控晝夜節律的分子機制并分離得到節律基因，獲得了2017年諾貝爾生理學或醫學獎。晝夜節律基因不僅控制晝夜節律，而且還調節生物體的生理機能和行為，如睡眠、攝食行為、體溫和血壓、激素分泌等。研究發現，晝夜節律的異常表達與人類多種疾病有關，如腫瘤。有研究報道，晝夜節律基因的破壞會導致某些惡性腫瘤的發生率提高，如乳腺癌、肺癌。乳腺癌是女性發病率最高的腫瘤，嚴重威脅女性健康。本研究通過統計學和生物信息方法探討節律基因在乳腺癌中的表達變化、甲基化和突變的改變，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 節律基因表達數據的獲取

首先從NCBI數據庫（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載基因功能注釋文件，并通過搜索關鍵詞“Rhythm/Circadian”篩選出與晝夜節律功能相關的184個基因。再通過NCBI-Gene數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）對每個基因進行檢索，并通過 NCBI-PubMed（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）數據庫搜索已有文獻證實的基因。最終確定了32個節律基因。從癌癥基因組譜數據庫（TCGA，https：//www.cancer.gov/）中獲取節律基因在乳腺癌中的表達數據，其中乳腺癌數據中有1109個腫瘤組織樣本和113個正常組織樣本。

1.2 節律基因甲基化和突變數據的獲取

從MethHC數據庫（https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/120）中獲得乳腺癌節律基因的甲基化數據，并用

t

檢驗分析腫瘤樣本和正常樣本中節律基因的甲基化差異性。從cBioPortal數據庫（http://www.cbioportal.org/）中收集乳腺癌節律基因的突變數據，并統計每個基因在乳腺癌樣本中的突變率。甲基化差異表達用R語言ggplot2程序包繪制，腫瘤樣本節律基因突變情況用Graphpad軟件繪制。

2 結果

2.1 節律基因在乳腺癌中的突變情況

獲取乳腺癌樣本節律基因突變數據發現，乳腺癌中大多數節律基因均顯示出高突變率，以突變率超過0.5%作為顯著突變的標準，超過30%的節律基因在乳腺癌中都發生了顯著突變，如：酪蛋白激酶1E（casein kinase 1 epsilon，CSNK1E）、纖溶酶原激活物抑制劑1型（serpin family E member 1，SERPINE1）、周期節律蛋白2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）、周期基因3（period 3，PER3）、PER2、PER1、永恒蛋白基因（timeless circadian regulator，TIMELESS）、核受體亞家族1D組成員1（nuclear receptor subfamily 1，groupD，member 1，NR1D1）、生物鐘基因（clock circadian regulator，CLOCK）、視蛋白 4（opsin 4，OPN4）。其中，

PER2

在乳腺癌中突變率較高，高達1%。（圖1）

圖1 乳腺癌中節律基因的突變情況

2.2 節律基因的異常甲基化情況

對獲取的乳腺癌樣本和正常樣本中的節律基因表達數據利用

t

檢驗分析發現，大多數節律基因在乳腺癌樣本中呈低表達，如：隱花色素蛋白2（cryptochromecircadian regulator2，CRY2）、

NR1D1

、

CSNK1E

、去乙?；?（sirtuin type 1，SIRT1）、早期生長反應因子 3（recombinant early growth response protein 3，EGR3）、

CRY1

、

PER1

、視黃醇類核內受體A（retinoic acid receptor-related orphan receptor A，RORA）、

RORB

、

NR1D2

、堿性-螺旋環-螺旋轉錄因子E41（basic-helix-loop-helix transcriptional factor E41，BHLHE41）、前動力蛋白 2（prokineticin 2，PROK2）、褪黑素受體 1A（melatonin receptor 1A，MTNR1A）、

CLOCK

、

PER3

、類芳香烴受體核轉位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like，ARNTL）、

OPN4

、核因子白細胞介素3調控蛋白（nuclear factor,interleukin 3 regulated，NFIL3）、

KIAA1737

。甲基化分析發現大多數節律基因在乳腺癌樣本中呈高甲基化，如：

NPAS2

、晝夜節律相關轉錄抑制因子（circadian associated repressor of transcription，C1orf51）、褪黑素受體 1B（melatoninreceptor1B，MTNR1B）、

CSNK1E

、

SIRT1

、

PER1

、

RORA

、

RORB

、

BHLHE41

、

PROK2

、

MTNR1A

、

SERPINE1

、

PER3

、

ARNTL

。（圖2）

圖2 乳腺癌中節律基因表達和甲基化水平

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在女性中居第一位，病死率居第二位，已經成為嚴重影響女性身心健康的重要疾病。目前乳腺癌的診斷和治療取得不斷進展，使乳腺癌患者的總生存期不斷延長。然而乳腺癌發生發展的具體機制目前尚未完全了解，導致對其針對性較強的治療方法較少。與大部分的惡性腫瘤相同的是，乳腺癌的發生發展也是在非常復雜的多種因素共同作用下出現的。研究表明，乳腺癌的發生與初潮和絕經年齡、腫瘤家族史、肥胖等因素有關。乳腺癌是受多種基因參與調控的一種多步驟、多階段的復雜生物學演變過程。進行較新的腫瘤相關基因探索，揭示其具體調控機制，可以為臨床腫瘤及其相關疾病的治療提供新的靶點及思路，對治療策略以及路徑均有十分重要的臨床意義。

晝夜節律的異常表達與腫瘤有關。節律基因在腫瘤發展中的作用研究正趨于成熟。第一，有研究顯示晝夜節律基因的破壞會導致某些惡性腫瘤的發生率提高。第二，有研究表明，在人類許多腫瘤類型中節律基因異常表達，如芳香烴受體核轉位蛋白樣1（aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocation protein like 1，BMAL1）在肝癌中表達增加；膠質瘤中

PER2

異常甲基化導致表達改變。

Ck1δ

和

Ck1ε

的突變與許多腫瘤的發生率提高相關。第三，節律基因的表達改變調控腫瘤的發展。例如，

Dec1

、

Dec2

和

PER1

的異常表達對惡性上皮細胞的增殖和遷移起到重要作用，破壞PER2的表達可促進膠質瘤細胞的惡變。本研究通過公共數據庫中的乳腺癌數據對節律基因的表達和功能進行了全面和系統的分析，結果表明在乳腺癌中節律基因的表達發生了顯著變化，大多數節律基因均顯示出高突變率，約超過30%的節律基因在乳腺癌中發生顯著突變，其中

PER2

在乳腺癌中突變率高達1%。這些結果表明節律基因在乳腺癌中的高突變率，有可能是導致乳腺癌發生的重要原因。同時對獲取的乳腺癌樣本和正常樣本中的節律基因表達數據利用

t

檢驗分析發現，大多數節律基因在乳腺癌樣本中呈低表達，甲基化分析發現大多數節律基因在腫瘤樣本中呈高甲基化，這可能是由于乳腺癌樣本中節律基因的異常高甲基化導致的基因表達水平的降低，表明這些節律基因在乳腺癌中的表達發生改變。這項研究不僅全面了解節律基因在乳腺癌中的變化，而且可能為乳腺癌的診斷和治療提供新的思路和方法。